[发明专利]一种携带AIM2基因的溶瘤腺病毒的构建方法及应用

权利要求书

1.一种携带AIM2基因的溶瘤腺病毒的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）CAIX启动子载体pZD55-CAIX的构建

通过PCR反应和克隆技术，从质粒pGL3-CAIX中获取218bp的CAIX核心启动子片段，然后插入到腺病毒质粒pZD55中，得到pZD55-CAIX；

（2）腺病毒穿梭质粒pZD55-CAIX-AIM2的构建

以pEF-BOS-AIM2为模板，PCR扩增获得不含终止子1029bp的AIM2序列，将其克隆至增殖缺陷腺病毒载体pCA13的HindIII、XbaI位点，获得pCA13-AIM2质粒；从pCA13-AIM2质粒中获取CMV+AIM2+PolyA表达框，将其插入pZD55-CAIX，得到重组腺病毒穿梭质粒pZD55-CAIX-AIM2；

（3）目的溶瘤腺病毒的制备

将通过鉴定的质粒pZD55-CAIX-AIM2与腺病毒骨架质粒pBHGE3共转染HEK293细胞，待细胞出现病毒噬斑后，得到目的溶瘤腺病毒Ad-CAIX-AIM2，

所述腺病毒穿梭质粒pZD55-CAIX-AIM2的序列如SEQ ID NO.:6所示。

2.如权利要求1所述携带AIM2基因的溶瘤腺病毒的构建方法，其特征在于，步骤（1）中，从质粒pGL3-CAIX中获取218bp的CAIX核心启动子片段的具体方法为：设计引物1，并在引物1的上游引物中引入Xho I酶切位点，在下游引物中引入SnaBI 酶切位点，其中上游引物序列为：5’-TTGTCTCGAGACCTGCCCCTCACTC-3’，下游引物序列为：5’-TTGCTACGTACATGCGGCTGACTG-3’；利用设计的引物1和质粒pGL3-CAIX，PCR扩增CAIX启动子片段，得到PCR产物，利用XhoI和SnaBI限制性内切酶对PCR产物进行双酶切，孵育后进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，胶回收获取218bp的CAIX核心启动子片段。

3.如权利要求1或2所述携带AIM2基因的溶瘤腺病毒的构建方法，其特征在于，步骤（2）中，PCR扩增所采用的上游引物的序列为5’-GATAAGCTTATGGAGAGTAAATACAAGGAGATACTCTT-3’、下游引物的序列为5’- TGCTCTAGACTATGTTTTTTTTTTGGCCTTAATAA-3’ ；PCR循环条件参数为：94℃ 3min，94℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 1 min 30s，32 个循环，72℃ 10min。

4.权利要求1或2或3所述所述方法制备得到的携带AIM2基因的溶瘤腺病毒在制备肾癌治疗药物中的应用。