[发明专利]一种人类TYMS基因表达水平检测试剂盒及使用方法

说明书

本发明提供一种人类TYMS基因表达水平检测试剂盒，包括用于检测TYMS基因表达水平的引物组和探针、用于检测内参基因β‑actin表达水平的引物组和探针，还包括标准对照品和阴性对照品。本发明还提供了一种人类TYMS基因表达水平检测试剂盒的使用方法。本发明通过设计扩增TYMS的特异性引物和探针，利用人工构建基因标准品模拟群体样本的中位值作为对照进行检测，并使用热启动酶保证检测结果的准确性和体系的稳定性。

技术领域

本发明应用于基因检测技术领域，具体涉及一种人类TYMS基因表达水平检测试剂盒及使用方法。

背景技术

氟类药物包括5-FU、替加氟、卡莫氟、氟尿苷、脱氧氟尿苷以及卡培他滨等,对消化道肿瘤及其他实体瘤均有良好疗效，在肿瘤内科治疗中占有重要地位。当氟类药物进入人体后，可被转化为活性代谢产物一磷酸氟尿嘧啶脱氧核苷(FdUMP)、三磷酸氟尿嘧啶脱氧核苷(FdUTP)和三磷酸氟尿嘧啶(FUTP)等嘧啶类核苷酸类似物，进而产生抗肿瘤活性。

TYMS(Thymidylate Synthetase，TS)基因编码的胸苷酸合成酶，是嘧啶核苷酸合成的限速酶，是肿瘤生长的重要因子，也是氟类药物发挥细胞毒作用的目标酶。氟类药物转化为FdUMP后，与TS、5,10-亚甲基四氢叶酸结合形成三联复合物，dUMP与TS结合后转化为脱氧胸腺嘧啶核苷dTMP，使DNA合成受限。多种肿瘤的临床研究均显示TYMS mRNA表达水平与氟类药物疗效密切相关，例如：结直肠癌、肺癌、乳腺癌、头颈鳞状细胞癌等。临床研究表明，低TYMS mRNA水平的肿瘤患者接受氟类药物化疗的效果较好，中位生存期较长。反之，TYMS高表达的患者接受氟类治疗疗效较差。

目前，在临床肿瘤标志物检测方法中，主要应用免疫组化法(化学染色)、流式细胞技术、免疫放射法等传统技术，但存在实验过程过于繁琐，结果读取主观影响较大等缺点。近年来，荧光定量PCR凭借检测时间短、检测敏感性高及能进行实时检测，反应基因在组织中的初始含量，检测时间短，还避免了遗留污染的发生等优点逐渐在临床上部分取代传统检验方法。荧光定量PCR常见方法有SYBR Green I染料法和TaqMan探针法。其中，SYBRGreen I由于是非饱和染料，特异性不如TaqMan法，且必须通过观察溶解曲线来判断其特异性。

现有文献和报道中常用的检测TYMS基因表达量检测方法，是在采用荧光定量PCR的基础上，人工合成标准品，然后通过相对定量的方法来判定TYMS mRNA拷贝数。通过人工合成标准品作为对照，只能检测样本中TYMS mRNA拷贝数，并不能比较该样本TYMS mRNA在大规模统计样本中TYMS mRNA水平高低。临床上主要是基于统计样本中中位值来判断待检样本TYMS表达水平的高低，因此采用单独检测TYMS mRNA拷贝数对于临床用药指导意义有限，临床还是需要大规模统计样本才可以判定某一样本中TYMS mRNA表达水平的高低。如果每次检测都要进行大规模统计样本分析用于临床用药指导，整个检测过程复杂，并且成本高。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的上述问题，提供一种人类TYMS基因表达水平检测试剂盒及使用方法。本发明基于荧光定量RT-PCR和多重PCR，通过设计扩增TYMS的特异性引物和探针，利用人工构建基因标准品模拟群体样本的中位值作为对照进行检测，并使用热启动酶保证检测结果的准确性和体系的稳定性。

本发明解决其技术问题是采用以下技术方案实现的：

一种人类TYMS基因表达水平检测试剂盒，包括用于检测TYMS基因表达水平的引物组和探针、用于检测内参基因β-actin表达水平的引物组和探针：

TYMS-F上游引物：TGACTTTATACACACTTTGGGAGA，

TYMS-R下游引物：CCTTCAATCTGAAAGTCTTCA，

TYMS-P探针：FAM-CTTCGAAAAGTTGAGAAAATTGATG-TRAMA；