[发明专利]淫羊藿来源半乳糖基转移酶及其在制备金丝桃苷中的应用

说明书

本发明公开了淫羊藿来源半乳糖基转移酶及其在制备金丝桃苷中的应用，属于基因工程及生物医药技术领域。本发明提供了半乳糖基转移酶及表达半乳糖基转移酶的重组酿酒酵母在催化合成黄酮类化合物方面的应用，可以使构建的重组酿酒酵母在不添加UDP糖基供体的情况下，催化UDP‑半乳糖转移至槲皮素、山奈酚、杨梅素、二氢槲皮素、二氢山奈酚、二氢杨梅素、非瑟酮、桑色素以及淫羊藿素等多种黄酮底物。

技术领域

本发明涉及淫羊藿来源半乳糖基转移酶及其在制备金丝桃苷中的应用，属于基因工程及生物医药技术领域。

背景技术

金丝桃苷(槲皮素-3-O-半乳糖苷，Hyperoside)是一种黄酮醇苷类化合物，最早从茱萸中分离获得，是一种重要的植物天然产物。其广泛存在于唇形科、金丝桃科、蔷薇科、桔梗科、豆科等多种植物中，但是单株植物的相对含量较低。金丝桃苷具有优异的生物学功能，发挥多种药理活性，包括抗炎症、抗抑郁、减少脑缺血损伤、抑制肿瘤、保护心肌等作用。金丝桃苷是多种中药材制剂的重要成分，例如通脉刺五加胶囊、心安胶囊、心血宁滴丸、郁可欣胶囊等多种单味或复方中药制剂中，均有测得相对含量较高的金丝桃苷。传统的金丝桃苷的提取方式多为植物抽提法，受到季节、产地、气候等诸多因素影响，具有药材产量不稳定，品质不均一等缺陷。此外，在抽提过程中，需要消耗大量的水以及酒精，同时也会产生生物废水废渣，对环境产生巨大的压力。

随着合成生物学的不断发展，越来越多的天然产物能够通过微生物进行合成，或者通过微生物进行关键步骤的催化，将廉价易得的天然产物转化成不易获得的高附加值产品。金丝桃苷可以看做是利用槲皮素作为底物，进行3位的O-半乳糖基化修饰获得。市场上，98％纯度的槲皮素价格约每千克300元，而同样98％纯度的金丝桃苷价格高达每千克约2500元，是槲皮素价格的8倍多，并且槲皮素提取手段更环保，产量巨大。此外，与槲皮素相比，金丝桃苷具有更优异的生物活性以及更好的水溶性。因此，利用微生物活性表达关键酶，进行全细胞催化生产金丝桃苷，具有极高的经济价值以及技术可行性。

半乳糖苷转移酶是一种特异性催化UDP-半乳糖转移至特定糖基受体的糖基转移酶。半乳糖苷转移酶具有很强的受体分子选择性以及催化位点特异性。淫羊藿的提取物中，有较大含量的半乳糖基化修饰的黄酮类天然产物，表明淫羊藿中存在活性较好的黄酮半乳糖苷转移酶。但是，淫羊藿来源的催化黄酮3位进行O-半乳糖基化的糖基转移酶尚未有报道，也没有利用相关酶进行酶法催化合成金丝桃苷的文章。

综上，将淫羊藿中挖掘获得的具有高度专一性以及强催化效率的半乳糖基转移酶，利用酿酒酵母表达，进行全细胞催化槲皮素转化生成金丝桃苷，是一种高效环保的金丝桃苷制备方法，具有巨大的生产应用潜力。

发明内容

本发明筛选了植物来源的新的糖基转移酶，将其在酿酒酵母中进行表达，构建获得重组酿酒酵母，并将筛选的糖基转移酶及表达该酶的酿酒酵母用于黄酮类化合物的制备，有助于实现食品级黄酮类化合物的工业化生产。

本发明的第一个目的是提供植物来源的糖基转移酶，其具有如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)由SEQ ID NO.1～3所示的氨基酸序列组成的蛋白质，

(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有糖基转移酶活性的由(a)衍生的蛋白质。

在一种实施方式中，所述糖基转移酶为半乳糖苷转移酶，来源于朝鲜淫羊藿，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的第二个目的是提供编码所述糖基转移酶的基因。

在一种实施方式中，所述基因如(a)或(b)：

(a)如SEQ ID NO.4～6任一所示的DNA分子；

(b)在严格条件下与(a)限定的DNA序列杂交且编码具有糖基转移酶活性的蛋白质的DAN分子。