[发明专利]基于单分子全内反射荧光成像技术的病毒快速检测方法

说明书

本发明提供一种基于单分子全内反射荧光成像技术的病毒快速检测方法，包括：A、向病毒标准品溶液中加入荧光核酸探针，作为待测溶液；B、将待测溶液置于全内反射荧光成像装置上进行荧光信号检测，根据所追踪荧光信号相位点的动态变化计算扩散系数，作为病毒粒子的单分子动力学指纹信号，利用Stocks‑Einstein方程计算病毒平均流体力学直径；C、用待测病毒样本替换病毒标准品，按照相同操作获得待测病毒的单分子动力学指纹信号和流体力学直径，若与上述相符，则表明待测病毒样本中含有同类型病毒。通过相符扩散系数的荧光点信号二维路径计数可实现定量检测。该方法具有简单、快速、高效、经济的优点，适合病毒的大规模快速检测。

技术领域

本发明涉及病毒检测技术，具体地说，涉及一种基于单分子全内反射荧光成像技术的病毒快速检测方法。

背景技术

新型冠状病毒，世界卫生组织(WHO)已将其正式命名为SARS-CoV-2，旧称 2019-nCoV。SARS-CoV-2有别于SARS-CoV，是具有特殊临床、病毒学和流行病学特征的新毒株。其导致的疾病称为COVID-19。

SARS-CoV-2属于Beta冠状病毒属(Betacoronavirus)，有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，常为多形性，直径60-140nm。SARS-CoV-2是正义单链RNA病毒，遗传物质约3万个碱基长度，蛋白质表面突出的刺突蛋白(S-Protein)是侵染宿主细胞的关键。 SARS-CoV-2与SARS-CoV病毒一样与人体呼吸道上皮细胞以及肺组织的血管紧张素转化酶2(ACE2)受体作用从而入侵细胞，但与ACE2蛋白结合的5个关键氨基酸有4 个发生了变化，维持了刺突蛋白与ACE2蛋白互作的原结构构象。

SARS-CoV-2主要通过飞沫和接触传播，在一些特定的条件下也会发生气溶胶传播，目前也有多个研究团队提出粪口传播和母婴传播也是值得高度警惕的潜在可能途径。感染SARS-COV-2病人的发病初期症状很隐蔽，潜伏期也比较长，大多在3-7 天，但也有个例超过20天。近9成感染SARS-CoV-2患者的临床表现出发热，近7成表现出咳嗽，也有呕吐和腹泻等其他症状，患者主要出现肺炎的症状，重症的患者会出现血氧不足。除肺部，其他器官与SARS-COV-2感染相关的损害表现有待进一步研究，有部分科学家认为SARS-CoV-2感染可合并ARDS、心肌损害、凝血功能异常、肾脏损伤、肝脏损害等多脏器损害。截至目前，还没有针对感染该病毒患者的特效药和疫苗。

目前对于病毒的快速检测主要采用以下三类方法：一是核酸类，核酸是由许多核苷酸单体聚合成的生物大分子化合物，包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸 (RNA)。DNA是储存、复制和传递遗传信息的主要物质基础。在RNA病毒中，RNA 作为遗传物质。每个物质都有独特的核酸序列作为遗传物质，通过对于核酸序列的检测就可以确定病毒。常见的核酸类检测技术有测序技术、聚合酶链式反应(PCR)、等温扩增、CRISPR技术等。该类型的检测是一种高特异性和高灵敏度的检测，但是对于该类型的检测，通常存在仪器成本高、检测时间长等的问题，如常用的选择性核酸扩增技术(RT-PCR)通常需要几个小时的检测时间。二是抗体抗原类，抗原是诱发机体产生免疫反应的物质，即诱导机体发生免疫应答。而抗体是在抗原诱导下由B细胞分化的浆细胞产生的与特定抗原特异性结合的免疫球蛋白。病毒的包膜表面突出有多种结构蛋白含有多个抗原表位，通过结构蛋白的特异性检测原理，可以诊断出病毒的存在。还有另一种方法就是利用机体免疫表达所产生免疫球蛋白，常用于检测的是免疫球蛋白M(Immunoglobulin M，IgM)和免疫球蛋白G(Immunoglobulin G，IgG)。IgM是最早且迅速产生的机体应答抗体，维持时间短，消失快，通常作为早期感染的指标。IgG是主要的抗体成分，其产生时间晚，但维持时间长，通常作为既往感染的指标。这类检测方法较核酸类时间短，约一刻钟左右，也无需其他额外仪器。但是，检测灵敏度变化受限，非特异性吸附易造成假阳性，且机体最早产生免疫球蛋白也需要几天时间，对于早期检测不适用。三是直接观察，随着现有光学显微镜和电子显微镜分辨率的提高可以实现细胞分子水平上对生物粒子进行多参数、快速的定量分析，如流式细胞术、透射电子显微镜负染色法。该类方法需要染色处理，至少需要30分钟，而且成本较高。