[发明专利]基于单分子全内反射荧光成像技术的病毒快速检测方法

权利要求书

1.基于单分子全内反射荧光成像技术的SARS-CoV-2快速检测方法，所述方法为非诊断目的，其特征在于，包括以下步骤：

A、以离子型卤化物溶液为试剂配制一定浓度的SARS-CoV-2病毒标准品溶液，向病毒标准品溶液中加入荧光标记的核酸探针，混匀作为待测溶液；

其中，所述荧光标记的核酸探针为3’端带有荧光标记的单链DNA序列，其长度为18～22个碱基；

B、将待测溶液置于全内反射荧光成像装置上进行荧光信号检测，根据所追踪荧光信号相位点的动态变化计算扩散系数，以扩散系数作为病毒粒子的单分子动力学指纹信号，利用Stocks-Einstein方程计算得到病毒平均流体力学直径；

C、用待测病毒样本替换步骤A中的SARS-CoV-2病毒标准品，按照相同的操作方法获得待测病毒的单分子动力学指纹信号和流体力学直径，若与上述病毒的单分子动力学指纹信号和平均流体力学直径相符，则表明待测病毒样本中含有与步骤A相同的病毒；

单分子水平上SARS-CoV-2追踪的实现是通过用于SARS-COV-2检测的全内反射荧光成像装置中的CCD元件对荧光信号进行成像，对于荧光信号的识别是首先基于对目标和背景有效地进行局域像素的分割，将其处理成灰度图像并进行二值化；对于亮点的荧光信号目标，二值化处理为：

其中，g(x,y)为像素点(x,y)坐标处的灰度值，T_h为灰度阈值；根据该结果将SARS-CoV-2的位置确定为(x,y)，由此实现不同所述待测荧光信号的局域化提取；对于其匹配算法主要是建立临近局域化荧光信号的关联，重建待测溶液中荧光标记SARS-CoV-2扩散的二维路径来实现单粒子追踪；根据最小二乘法对于相邻时间间隔的荧光点信号的位置进行确认与关联，定义均值为：

相关函数为：

其中，M为提取局域信号长、宽方向的像点数；当R(x,y)达到最小值时，即认为该荧光信号为目标SARS-CoV-2下一时刻的目标点，以实现追踪与预测；根据追踪荧光信号相位点的动态变化实现单分子的二维路径追踪与预测。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述离子型卤化物选自CaCl₂、MgCl₂、NaCl、KCl中的至少一种。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述全内反射荧光成像装置包括光学显微系统、荧光激发系统、信号采集系统和微流控样品池；

所述光学显微系统包括盖玻片、物镜、二向色镜、发射滤光片和反射镜；

所述荧光激发系统包括激光器，用于提供激发光光源；

所述信号采集系统包括电荷耦合器件和计算机，用于接收荧光信号，并将所述荧光信号转换为对应的图像数据信号；

所述微流控样品池用于贮存待测溶液并将所述待测溶液驱动至光学显微系统的检测区。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述全内反射荧光成像装置还包括蠕动泵系统；

所述蠕动泵系统包括依次连接的蠕动泵、泵管以及抽吸针管，用于将所述待测溶液以恒定速度驱动至所述微流控样品池的储液槽内。