[发明专利]一种免疫细胞无血清冻存液及冻存方法

说明书

本发明公开了一种免疫细胞无血清冻存液，其特征在于，包括基础培养基和细胞冻存保护剂，所述细胞冻存保护剂由以下原料组成：聚乙二醇、壬基酚聚氧乙烯醚‑10、皂荚多糖、羧甲基纤维素钠、聚甘油脂肪酸酯、竹叶黄酮。本发明采用聚乙二醇、壬基酚聚氧乙烯醚‑10复配替代DMSO，改变细胞膜的通透性同时对细胞膜起到保护作用，使细胞内的自由水排除细胞外，减少在冻存过程中细胞内形成冰晶对细胞造成损害。添加皂荚多糖、羧甲基纤维素钠、聚甘油脂肪酸酯作为渗透压稳定剂，使细胞外环境保持稳定的渗透压。添加有竹叶黄酮，有助于细胞复苏后快速恢复活性。本发明还提供了一种免疫细胞的冻存方法，过程简便，满足科研、医疗等领域对免于细胞的需求。

技术领域

本发明涉及细胞培养领域，尤其涉及一种免疫细胞无血清冻存液及冻存方法。

背景技术

免疫细胞是指参与免疫应答或与免疫应答相关的细胞，包括淋巴细胞、树突状细胞、单核/巨噬细胞、粒细胞、肥大细胞等。免疫细胞可以分为多种，在人体中各种免疫细胞担任着重要的角色。免疫细胞包括吞噬细胞和淋巴细胞，淋巴细胞中的T细胞、B细胞是发挥特异性免疫的主要细胞群。从血液中分离出来的单个核细胞包括：T细胞、B细胞、NK细胞和DC细胞等，是免疫细胞治疗中的初始细胞来源，经各类细胞因子诱导扩增培养，得到一群具有高效杀伤活性的免疫细胞群。

细胞冻存技术作为一种保存细胞的有效方法在生物学领域已有深入广泛的应用。对供体的免疫细胞深低温保存可保持其活力和功能，无论对临床还是基础研究均具有重要意义。冷冻保存免疫细胞不仅可以解决现有免疫细胞诱导时间较长，需要多次诱导和患者多次采血的问题，还可以把人健康状态的免疫细胞保存下来，用于肿瘤治疗等。

细胞冻存主要是采取-196℃超低温条件下的保存方案，在超低温条件下，细胞的代谢功能停滞，但并未死亡。而细胞复苏则是冻存细胞在36-40℃快速解冻的过程，以恢复细胞的活性和功能。细胞在不加任何保护剂的情况下直接冷冻会导致冷冻损伤效应的发生，冷冻后细胞内外的水分会很快形成冰晶，冰晶的形成将引起一系列的不良反应。首先细胞脱水使局部电解质浓度增高，pH值改变，部分蛋白质由于上述因素而变性，引起细胞内部空间结构紊乱。细胞内冰晶的形成和细胞膜系统上蛋白质、酶的变性引起溶酶体膜的损伤使溶酶体释放，造成细胞内结构成分的破坏、线粒体肿胀、功能丧失并造成细胞能量代谢的障碍。细胞膜上的类脂蛋白复合体在冷冻中易发生破坏，引起细胞膜通透性的改变，使细胞内容物丧失。随着冷冻温度的降低，冰晶体积膨胀造成细胞核内DNA的空间构型发生不可逆的损伤性变化，从而引起细胞的死亡。最终导致复苏后细胞存活率低、细胞增殖数量不足等问题。

细胞冻存经常采用渗透性保护剂，例如甘油和二甲基亚砜(DMSO)两种，而甘油作为冷冻保护剂冻存的免疫细胞存活率较低，DMSO可以迅速透入细胞，提高细胞膜对水的通透性，使水分在细胞冻结前透出细胞外形成冰晶，成为免疫细胞冻存最理想的冷冻保护剂。但在冻存过程中，现有的冻存液仍不可避免的会对单个细胞产生损伤，甚至毒性，尤其是冻存过程中会显著改变细胞的热力学、化学和物理环境，同时伴随生物性损伤的危险。因此，为提供足够量的免疫细胞，现有技术中冻存细胞复苏后的存活率仍需进一步提高，同时也应避免回输给患者时出现呕吐或过敏等不良反应，提高安全性。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种免疫细胞冻存液，不添加外源血清，减小冻存过程中对免疫细胞造成的损伤，提高免疫细胞的存活率。

本发明的目的之二在于提供一种免疫细胞的冻存方法。

本发明的目的之一采用如下技术方案实现：

一种免疫细胞无血清冻存液，包括基础培养基和细胞冻存保护剂，所述细胞冻存保护剂由以下原料组成：聚乙二醇、壬基酚聚氧乙烯醚-10、皂荚多糖、羧甲基纤维素钠、聚甘油脂肪酸酯、竹叶黄酮。