[发明专利]一种基于RGO-CS-Fc/Pt-Pd NPs纳米复合材料检测GPC3的方法

说明书

本发明是以肝癌标志物磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（Glypican‑3,GPC3）为研究对象，以GPC3适配体为识别探针，基于还原性氧化石墨烯‑壳聚糖‑二茂铁/纳米铂、钯（Pt‑Pd NPs/RGO‑CS‑Fc）复合材料良好的电子传递效应和优异的负载能力，GPC3适配体能够特异性识别和结合GPC3蛋白，构建一种能对GPC3蛋白进行特异性识别以及定量分析的新型适配体传感器，用以检测血清中GPC3的含量。该方法操作简单、省时、费用低且具有较低的检测限。

技术领域

本发明属于生物检测领域，具体涉及一种基于纳米复合材料结合适配体来检测磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3（GPC3）的方法。

背景技术

原发性肝细胞癌（HCC）是一种在我国较为常见，容易对人们生命造成威胁的恶性肿瘤。常见的肝癌标志物有AFP、GPC3、GP73等。GPC3在常人组织中则是以非常低的浓度存在，但在肝癌患者体内浓度会很高，因此GPC3与肝癌的发生、发展密切相关。GPC3检测方法主要有放射免疫分析法、荧光免疫分析法、酶联免疫吸附法、化学发光免疫分析法、流式免疫分析法、电化学免疫传感器、压电免疫传感器等。公开号CN 105717104 B的发明专利，涉及一种利用膜过滤装置分离获取无法获得组织标本的肝癌患者外周血中的CTC，运用细胞蜡块技术制作薄层切片，进而检测肝细胞癌患者外周血GPC3表达情况的方法。公开号CN105759051 B的发明专利，涉及一种以吖啶酯为发光标物的GPC3纳米磁微球化学发光免疫分析测定磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3的定量分析试剂盒。这些方法所用仪器昂贵、操作复杂、费时且技术要求较高，需要建立一种快速、操作简便的GPC3检测方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种基于还原性氧化石墨烯-壳聚糖-二茂铁/纳米铂-钯（RGO-CS-Fc/Pt-Pd NPs）的纳米复合材料结合适配体来检测GPC3的方法，提高灵敏度、增强特异性。

为了解决该技术问题，采用电沉积技术以及静电吸附作用制作了基于RGO-CS-Fc/Pt-Pd NPs的GPC3纳米适配体电化学生物传感器。采用电化学工作站的微分脉冲伏安法(DPV)，记录其峰电流。对GPC3的孵育温度、孵育时间、PBS的pH值、RGO-CS-Fc复合材料的用量和GPC3适配体浓度进行了优化，绘制了标准曲线，通过与标准工作曲线对比计算得到准确的GPC3浓度。与现有的方法相比，操作相对简单，特异性高，时间和费用的消耗更少，能达到3.67 ng/mL的检测限。

本发明的检测原理为：采用电沉积技术以及静电吸附作用将RGO-CS-Fc/Pt-PdNPs修饰在丝网印刷电极表面。通过非共价结合作用以及分子间作用力将GPC3适配体负载在RGO-CS-Fc/Pt-Pd NPs材料表面，适配体因其较为不稳定的空间结构而以单链形式与复合材料连接，进而能够被修饰到电极上。在生物传感界面上加入GPC3后，GPC3适配体会特异性结合GPC3蛋白，形成蛋白-适配体复合物而呈稳定的空间结构，从而有序排列在电极表面。通过DPV方法检测GPC3前后在PBS溶液（0.2 mol/L，pH 7.4）中的电化学信号（扫描的电压是 -0.4 V-1.0 V，扫描速率为0.01V/s），并描绘出该电流与GPC3浓度的关系曲线，从而实现对GPC3的检测。

本发明按照以下步骤进行：

步骤1：RGO-CS-Fc材料的制备

(1)还原性氧化石墨烯（RGO）的制备：氧化石墨烯（GO）倒入蒸馏水中，使用超声细胞破碎仪超声，使其充分溶解均匀，制成GO水溶液。取GO水溶液置于烧杯中，加入抗坏血酸（AA）使其还原GO，得RGO。

(2)壳聚糖-二茂铁(CS-Fc)的制备：将壳聚糖（CS）加入乙酸溶液中，得壳聚糖溶液。将二茂铁甲酸（Fc）与壳聚糖溶液混合，以碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺（EDC/NHS）活化，搅拌得CS-Fc复合物。