[发明专利]一种基于RGO-CS-Fc/Pt-Pd NPs纳米复合材料检测GPC3的方法

权利要求书

1.一种基于RGO-CS-Fc/Pt-Pd NPs纳米复合材料检测GPC3的方法，按以下步骤进行：

步骤1：RGO-CS-Fc材料的制备

（1）还原性氧化石墨烯的制备：氧化石墨烯倒入蒸馏水中，使用超声细胞破碎仪超声，使其充分溶解均匀，制成GO水溶液；取上述GO水溶液置于烧杯中，加入抗坏血酸使其还原GO，得RGO；

（2）壳聚糖-二茂铁的制备：将壳聚糖加入乙酸溶液中，得壳聚糖溶液；将二茂铁甲酸与壳聚糖溶液混合，以EDC/NHS活化，搅拌得CS-Fc复合物；

（3）还原性氧化石墨烯-壳聚糖-二茂铁复合材料的制备：取RGO悬液加入到CS-Fc溶液中，EDC/NHS活化，离心分离得RGO-CS-Fc悬浊液；

步骤2：电极的修饰与生物传感界面的构建

（1）将丝网印刷电极置于H₂SO₄溶液中，进行循环伏安扫描，得到活化后的丝网印刷电极，用水冲洗干净；

（2）将活化后的丝网印刷电极置入氯铂酸和硝酸钯溶液中，进行恒电位沉积，沉积结束后用水将电极冲洗干净，得到Pt-Pd NPs/SPE电极；

（3）将Pt-Pd NPs/SPE电极用戊二醛浸泡，用PBS洗涤，吹干，而后滴加RGO-CS-Fc悬浊液孵育一段时间，PBS洗涤，晾干，得到RGO-CS-Fc/Pt-Pd NPs/SPE电极；

（4）取氨基化的GPC3适配体滴加到传感器界面，孵育一段时间，用PBS溶液洗涤未固定到界面的GPC3适配体，滴加BSA溶液进行封闭，得到GPC3apt /RGO-CS-Fc/Pt-Pd NPs/SPE传感界面，晾干备用；

步骤3：GPC3的工作曲线绘制

（1）将标准GPC3溶液滴加到步骤2得到的GPC3apt/RGO-CS-Fc/Pt-Pd NPs/SPE传感界面， 孵育一段时间，用PBS溶液清洗，得到工作电极，晾干备用；

（2）将工作电极放入PBS溶液中，采用电化学工作站的DPV扫描，记录其峰电流；

（3）分别对不同浓度的GPC3进行检测，绘制标准曲线，计算出该方法的最低检测限；

步骤4：实际样品中GPC3的检测

（1）在步骤2得到的GPC3apt/RGO-CS-Fc/Pt-Pd NPs/SPE传感界面，滴加待测实际样品，孵育一段时间，用PBS溶液清洗，得到工作电极，晾干备用；

（2）将工作电极放入PBS溶液中，采用电化学工作站的DPV扫描，记录其峰电流；

（3）根据步骤3所述标准曲线，得到所述待测实际样品中GPC3的浓度。

2.按照权利要求1所述检测GPC3的方法，其特征在于：步骤1中所述乙酸为100 mL 1%。

3.按照权利要求1所述检测GPC3的方法，其特征在于：步骤1中所述EDC/NHS浓度为10mmol/L。

4.按照权利要求1所述检测GPC3的方法，其特征在于：步骤2中所述将电极置于0.5mol/L H₂SO₄中进行循环伏安扫描20段，电压范围为-0.4V-1.2V。

5.按照权利要求1所述检测GPC3的方法，其特征在于：步骤2中用于纳米铂、钯的沉积溶液为浓度为0.01%的氯铂酸和0.01%硝酸钯，沉积电位为-0.2 V，沉积时间120 s。

6.按照权利要求1所述检测GPC3的方法，其特征在于：步骤2中所述BSA溶液为6 μL0.5%的BSA溶液。

7.按照权利要求1所述检测GPC3的方法，其特征在于：步骤3和步骤4中所述的孵育温度为37°C，孵育时间为20分钟。

8.按照权利要求1所述检测GPC3的方法，其特征在于：步骤3和步骤4中所述DPV扫描所用的溶液为0.2 mol/L，pH值为7.4的PBS溶液。

9.按照权利要求1所述检测GPC3的方法，其特征在于：步骤3和步骤4中所述的扫描范围为-0.4 V-1.0 V，扫描速率为0.01V/s。