[发明专利]一种基于CRISPR/Cas9的DNA检测方法及其应用

说明书

本发明公开了一种基于CRISPR/Cas9的DNA检测方法及其应用，该方法通过将待检DNA分子与一对dCas9‑sgRNA室温孵育，形成dCas9‑sgRNA‑DNA‑dCas9‑sgRNA复合物，再利用sgRNA上的捕获序列将复合物捕获到固相基质表面并捕获信号报告分子，实现靶DNA分子的检测。本发明的方法可在不经传统核酸检测中进行核酸扩增、核酸杂交等复杂、耗时环节的情况下，快速、简单地实现低至飞摩级DNA分子的检测。本发明成功避免了目前核酸检测和分型领域中核酸杂交和扩增等关键瓶颈问题，实现了可视化和超灵敏的DNA快速检测，在核酸检测领域具有极其广泛的应用价值。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体一种基于CRISPR/Cas9的DNA检测方法及其应用。

背景技术

对于基础研究、各种检测及诊断应用，DNA检测和基因分型一直很重要。因此，DNA检测和基因分型技术一直受到广泛关注，从而促进了该类技术发展。归纳起来，主要有三类DNA检测和基因分型技术被广泛应用。第一种是基于聚合酶链反应(PCR)的各种技术。PCR是最常用的DNA检测和基因分型技术。基于PCR的DNA检测和基因分型主要依赖于特异性引物的设计和多重PCR扩增。PCR检测可以通过传统PCR(tPCR)，定量PCR(qPCR)和最近开发的数字PCR来实现。因为具有明显的优点，如实时检测和高灵敏度，Q-PCR在几乎所有的研究、检测和诊断实验室中得到高度普及。现在已经开发出更准确的数字PCR，作为临床检测工具，具有很大的潜力和优势。然而，PCR技术在用于区分高度相关的基因型时，要受到多重扩增和高度特异性引物的限制。除PCR技术外，DNA微阵列等多种DNA杂交技术也被广泛用于检测和分型DNA。然而，由于其昂贵的设备，复杂的检测流程和难以避免的非特异性杂交，DNA微阵列技术不能像PCR一样成为常规DNA检测和基因分型工具。DNA测序是另一种有效的DNA检测和基因分型技术。特别是随着下一代测序(NGS)技术的出现，诸如Illumina NovaSeq等NGS平台的DNA测序工具越来越多。然而，由于需要昂贵的设备和化学试剂，它们仍然不能像PCR一样用于常规研究，检测和诊断。此外，近年来还开发出了各类核酸等温扩增技术用于核酸检测，如滚环扩增(RCA)、重组酶聚合酶扩增(RPA)、多重置换扩增(MDA)、环介导等温扩增技术(LAMP)、依赖核酸序列的扩增(NASBA)、解旋酶依赖扩增(HDA)、切刻酶扩增反应(NEAR)等，但这些检测技术都依赖形形色色的目标核酸的扩增程序才能实现核酸的检测。

Ishino等人于1987年首先在大肠杆菌(E.coli)的基因组中发现了成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)，并由Jansen等人在2002年定义为CRISPR。现在，已知的CRISPR系统包括三种不同类型(类型I，II和III)。I型和III型系统由多种Cas蛋白组成，而II型系统只需要一种Cas蛋白Cas9。Cas9与CRISPR相关的RNA(crRNA)和反式激活的crRNA(tracrRNA)相关联。TracrRNA能够激活Cas9核酸酶，crRNA与目标DNA的20个核苷酸序列互补。因此后者决定了CRISPR-Cas9系统的特异性。crRNA引导的Cas9核酸酶可以与原始毗邻基序(PAM)相邻的靶DNA结合，并在PAM序列(NGG)上游三个碱基处切割靶DNA。将tracrRNA和crRNA整合成一个单导向RNA(sgRNA)后，极大地简化了II型CRISPR系统的应用。由sgRNA引导着Cas9去切割靶DNA。目前，CRISPR-Cas9系统由于其简便性和高效性，被许多研究者广泛应用于基因组编辑领域。另外，dCas9(dead Cas9)是由Cas9改造而成，其失去了核酸酶活性，但保留基因转录激活结构域(AD)或抑制结构域(ID)，dCas9(dead Cas9)作为一种新的人工转录因子已被广泛应用于内源性基因表达调控。