[发明专利]一种基于CRISPR/Cas9的DNA检测方法及其应用

权利要求书

1.一种基于CRISPR/Cas9的DNA检测方法使用的一对dCas9-sgRNA在制备检测各种DNA分子的检测试剂中的应用，其特征在于，包括如下步骤：

（1）将待检DNA分子与一对dCas9-sgRNA孵育，形成dCas9-sgRNA-DNA- dCas9-sgRNA复合物；

（2）利用其中一个dCas9-sgRNA的sgRNA上的捕获序列将dCas9-sgRNA-DNA-dCas9-sgRNA复合物捕获到固相基质表面；

（3）利用另一个dCas9-sgRNA的sgRNA上的捕获序列捕获信号报告分子。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤（1）所述一对dCas9-sgRNA是指两种dCas9-sgRNA复合物，即dCas9-sgRNAa和dCas9-sgRNAb；其中sgRNAa与sgRNAb分别具有不同的5′端靶DNA结合序列与3′端捕获序列。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述sgRNAa的3′端捕获序列的序列为（SEQID NO.1）5′-CGGAA CCTTA CGAAT ACCAG ATGC-3′；所述sgRNAb的3′端捕获序列的序列为（SEQ ID NO.2）5′-TACTT CATGT TACAG ACGAC TCCCA C-3′或（SEQ ID NO.3）5′-ATCTAGTGGA ACCTC AAACA TACC-3′。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述sgRNAa及sgRNAb的5′端靶DNA结合序列均为20 bp长度的序列，通过与靶DNA杂交引导dCas9-sgRNA复合物与靶DNA结合形成dCas9-sgRNA-DNA-dCas9-sgRNA复合物；所述sgRNAa及sgRNAb当用于检测乳头状瘤病毒DNA分子时，sgRNAa及sgRNAb的5′端靶DNA结合序列选自序列SEQ ID NO.4-33中的一对；检测大肠杆菌T7 RNA聚合酶DNA时，sgRNAa及sgRNAb的5′端靶DNA结合序列的分别为序列SEQ IDNO.34-35；在检测突变型TERT启动子DNA时，sgRNAa及sgRNAb的5′端靶DNA结合序列分别为序列SEQ ID NO.36-37。

5.根据权利要求1-4任一所述的应用，其特征在于，步骤（2）所述利用sgRNA上的捕获序列将dCas9-sgRNA-DNA-dCas9-sgRNA复合物捕获到固相基质表面，是指借助sgRNAa的3′端捕获序列可将dCas9-sgRNA-DNA-dCas9-sgRNA复合物捕获到固相基质表面。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤（2）所述固相基质包括各种固相基质，包括微球、微孔板、玻璃片或者纳米颗粒；所述固相基质表面固定有捕获寡核苷酸；其中捕获寡核苷酸的序列与sgRNAa的3′端捕获序列碱基互补；其中捕获寡核苷酸的序列为（SEQID NO.38）5'-GCATC TGGTA TTCGT AAGGT TCCG-3'。

7.根据权利要求1-4任一所述的应用，其特征在于，步骤（3）所述利用sgRNA上的捕获序列捕获信号报告分子，是指借助sgRNAb的3′端捕获序列将信号报告分子捕获到dCas9-sgRNA-DNA-dCas9-sgRNA复合物上。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤（3）所述信号报告分子为杂交链反应发卡1；其中所述杂交链反应由发卡1和发卡2两种DNA分子组成；其中sgRNAb的3′端捕获序列（SEQ ID NO.39）5′-TACTT CATGT TACAG ACGAC TCCCA C-3′可通过杂交打开发卡1；打开的发卡1可与发卡2杂交，打开发卡2；打开的发卡2又可与发卡1杂交，打开发卡1；如此循坏，形成不断延长的DNA链；所述发卡1的3′端序列为（SEQ ID NO.40）5′-G TGGGA GTCGT CTGTAACATG AAGTA-3'。