[发明专利]牛奶中3种致病菌多重PCR诊断试剂盒

说明书

本发明公开了一种牛奶中3种致病菌多重PCR诊断试剂盒。所述试剂盒的引物是金黄色葡萄球菌femB基因序列、大肠杆菌phoA基因序列和沙门氏菌invA基因序列的特异性引物。本发明通过对多重PCR反应进行优化，通过优化试验，确定该试剂盒的多重PCR的最佳扩增程序为：95℃5min；95℃30s，50～60℃35s，72℃45s，扩增30个循环；最后72℃延伸10min。本发明提供的多试剂盒可以对临床牛奶样本中的金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和大肠杆菌单独或混合感染进行快速、准确的检测及鉴定。试验结果证实，该试剂盒检测时间短、敏感性好、特异性高，具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明属于食源性致病菌检测技术领域，尤其是牛奶中3种致病菌多重PCR诊断试剂盒。

背景技术

食源性致病菌是引起人类健康和食品安全的主要因素之一，而微生物污染是导致牛奶质量问题的重要因素，因此牛奶中的致病菌成为消费者关注的焦点。而我国对原料奶的质量要求远低于乳业发达国家。我国乳品新国标中仅规定了生奶中细菌的最低检出总数(少于2×10⁶个/mL)，未对牛奶中具体的细菌种类进行规定，这忽视病原菌的检测。大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌则是牛奶源主要的致病菌，这些食源性致病菌严重影响着人和动物的健康。因此，需要快捷、灵敏地方法对牛奶中食源性致病菌进行检测。

目前也有不少关于牛奶食源性致病菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌的检测研究，但没有关于牛奶中大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌这3种致病菌的同时检测研究。

如公开号为CN104911249A的专利公开了一种快速检测奶源动物以及原料乳中金黄色葡萄球菌的试剂盒；所述试剂盒包括(1)牛奶中微生物的提取试剂，(2)PCR检测试剂，其中包括3对特异性的mntc基因的引物，(3)阳性对照，(4)阴性对照和(5)空白质控标准品。

又如公开号为CN108570512A的专利公开金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌三重荧光定量PCR检测的引物、探针及方法。金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌三重荧光定量PCR检测的引物和探针，包括分别以金黄色葡萄球菌nuc基因、大肠杆菌O157：H7 wzx基因、沙门氏菌invA基因为对象的三组引物和探针，并建立了金黄色葡萄球菌、大肠杆菌0157：H7、沙门氏菌三重荧光定量PCR方法。本发明的PCR检测方法灵敏度高：金黄色葡萄球菌和沙门氏菌灵敏度为10⁵copies/μL，而大肠杆菌灵敏度10⁴copies/μL。该专利技术虽然实现了金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌的同时检测，但是荧光定量PCR耗材昂贵，目前在县级基层以及养殖场还没有普及，且操作技术要求高，对操作环境洁净度要求高，由于环境污染易产生假阳性。

发明内容

本发明的目的在于提供牛奶中3种致病菌多重PCR诊断试剂盒。

多重PCR(multiplex PCR，mPCR)方法可同时检测多种病原体，且具有特异性强、灵敏度高、检测时间短和检测成本低等特点，适合大量临床样本(特别是混合感染样本)中病原体的快速检测。本发明研究者以金黄色葡萄球菌femB基因序列、大肠杆菌phoA基因序列和沙门氏菌invA基因序列，分别设计3对特异性引物，建立一种能够同时快速检测牛奶中三种食源性致病菌的多重PCR方法。

具体是通过以下技术方案实现的：

牛奶中3种致病菌多重PCR诊断试剂盒，包括Ⅰ液，Ⅰ液为混合引物，由以下引物组成：

金黄色葡萄球菌上引物：5′-CGAGCATCATGGCTTTACAACT-3′

金黄色葡萄球菌下引物：5′-CAAATCCAGCACGCTCTTCAGT-3′

大肠杆菌上引物：5′-CGATGCCTTACCGCTTAC-3′

大肠杆菌下引物：5′-TTTCCCTGCCATTCACC-3′