[发明专利]牛奶中3种致病菌多重PCR诊断试剂盒

权利要求书

1.牛奶中3种致病菌多重PCR诊断试剂盒，其特征在于，包括Ⅰ液，Ⅰ液为混合引物，由以下引物组成：

金黄色葡萄球菌上引物：5′-CGAGCATCATGGCTTTACAACT-3′

金黄色葡萄球菌下引物：5′-CAAATCCAGCACGCTCTTCAGT-3′

大肠杆菌上引物：5′-CGATGCCTTACCGCTTAC-3′

大肠杆菌下引物：5′-TTTCCCTGCCATTCACC-3′

沙门氏菌上引物:5′-ATTACTTGTGCCGAAGAGCC-3′

沙门氏菌下引物：5′-CCCTTTGCGAATAACATCCT-3′。

2.如权利要求1所述的牛奶中3种致病菌多重PCR诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括Ⅱ液，Ⅱ液为2U/μL DNA聚合酶。

3.如权利要求1所述的牛奶中3种致病菌多重PCR诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR反应混合溶液(Premix Ex Taq)，其组成为：5mmol/μL氯化镁、1000pmol/μL dNTP4.0μL、25mmol/μL Tris-HCl、0.2μL Taq。

4.如权利要求1所述的牛奶中3种致病菌多重PCR诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阴性对照、阳性对照。

5.如权利要求4所述的牛奶中3种致病菌多重PCR诊断试剂盒，其特征在于，所述阴性对照为超纯水，阳性对照为金黄色葡萄球菌fem B基因、大肠杆菌phoA基因、沙门氏菌invA基因三基因的克隆质粒。

6.如权利要求1-5所述的牛奶中3种致病菌多重PCR诊断试剂盒，所述试剂盒包括：40μLⅠ液、250μLⅡ液、250μL PCR反应混合溶液(Premix Ex Taq)、20μL阴性对照、20μL阳性对照；Ⅰ液由10μmol/L的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌上下引物等体积组成。

7.如权利要求6所述的牛奶中3种致病菌多重PCR诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的PCR扩增体系为：Premix Taq 25μL，DNA混合模板2μL，10μmol/L的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌上下引物各1μL，ddH₂O加至50μL。

8.如权利要求7所述的牛奶中3种致病菌多重PCR诊断试剂盒，所述试剂盒的扩增程序为：95℃5min；95℃30s，50～60℃35s，72℃45s，扩增30个循环；最后72℃延伸10min。

9.如权利要求8所述的牛奶中3种致病菌多重PCR诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的扩增产物采用1％琼脂糖凝胶电泳检测。

10.如权利要求9所述的牛奶中3种致病菌多重PCR诊断试剂盒，所述电泳检测：在233bp、444bp和724bp处显示出目的产物条带，则表明检测病原菌为金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌。