[发明专利]稳定表达敲入EGFP的IFNGR2基因黑色素瘤B-16细胞系的构建方法

说明书

本发明公开了一种稳定表达敲入EGFP的IFNGR2基因黑色素瘤B‑16细胞系的构建方法。本发明将绿色荧光蛋白EGFP基因序列敲入到细胞内IFNGR2基因的最后一个外显子末端，使其和IFNGR2基因融合表达。结果表明，EGFP的荧光强度与IFNGR2表达量成正相关可指示IFNGR2的表达水平，提示该细胞系可用于IFNGR2的表达调控研究。本发明为发现IFNGR2的表达调控因子和靶向肿瘤免疫的药物筛选提供有力工具。

技术领域

本发明涉及一种稳定表达敲入EGFP的IFNGR2基因黑色素瘤B-16细胞系的构建方法。

背景技术

肿瘤免疫治疗是指通过激活机体免疫系统的内在能力，靶向攻击肿瘤细胞，达到控制肿瘤发展和杀灭肿瘤目的的治疗方法。肿瘤免疫治疗主要包括免疫疫苗、免疫检查点抑制剂治疗、过继性免疫细胞治疗、细胞因子治疗等,其中免疫检查点抑制剂治疗以其显著的临床疗效而备受瞩目。然而目前临床试验数据显示，免疫检查点抑制剂仅对约20％的患者有效，导致治疗失败的原因和机制还未被充分阐明。

IFNγ信号通路在免疫检查点抑制剂治疗中发挥重要的作用。Gao J等发现肿瘤细胞中IFNγ信号通路的缺失导致了肿瘤细胞对药物的耐受，从而导致抗CTLA4治疗的失败。Benci JL等发现IFNγ信号通路可以调节肿瘤细胞对免疫检查点药物的敏感性。此外,Jesse M.Zaretsky也报道了在黑色素瘤细胞系IFNγ信号通路相关基因表达异常，导致抗PD-1治疗失败。以上研究提示，提高肿瘤细胞对IFNγ的敏感性有可能改善免疫检查点药物的疗效。

IFNγ通过与细胞膜上的受体结合，激活Janus激酶/信号转导与转录激活因子(Janus kinase/signal transducers and activators of transcription，JAK/STAT)信号通路，磷酸化的STAT入核进而调控干扰素诱导基因的表达。干扰素γ受体(IFNγR)包含两种不同亚基，分别是IFNGR1和IFNGR2。研究表明，细胞表面IFNGR1的表达是过量的，但是IFNGR2的表达却是受到严格调控，其表达量决定了细胞对IFNγ信号的反应性。阐明IFNGR2的表达调控机制有助于阐明IFNγ信号通路的调控方式和机制，从而为提高肿瘤的免疫治疗效果提供新的策略。

发明内容

本发明的目的是提供一种稳定表达敲入EGFP的IFNGR2基因黑色素瘤B-16细胞系的构建方法。

第一方面，本发明保护一种细胞系的制备方法，包括如下步骤：利用CRIS-PITCh系统对B-16黑色素瘤细胞进行基因编辑，将绿色荧光蛋白EGFP的编码基因插入B-16黑色素瘤细胞中IFNGR2基因的第七外显子末端，使所述绿色荧光蛋白EGFP的编码基因与IFNGR2基因融合表达；所述CRIS-PITCh系统包括sgRNA表达盒；所述sgRNA的靶序列为如下(a1)或(a2)：

(a1)SEQ ID NO.1自5’端第15884-15903位；

(a2)SEQ ID NO.1自5’端第15939-15958位。

所述CRIS-PITCh系统包括载体甲及载体乙；所述载体甲包括Cas9表达盒、sgRNA表达盒和PITCh sgRNA表达盒；所述载体乙包括供体片段和位于供体片段两端的同源臂；所述供体片段为如下(b1)或(b2)：

(b1)SEQ ID NO.4自5’端第1595-2974位；

(b2)SEQ ID NO.5自5’端第28-1407位。

位于(b1)所述的供体片段两端的同源臂为SEQ ID NO.4自5’端第1567-1586位所示的上游同源臂和SEQ ID NO.4自5’端第2975-2994位所示的下游同源臂。