[发明专利]稳定表达敲入EGFP的IFNGR2基因黑色素瘤B-16细胞系的构建方法

权利要求书

1.一种细胞系的制备方法，包括如下步骤：利用CRIS-PITCh系统对B-16黑色素瘤细胞进行基因编辑，将绿色荧光蛋白EGFP的编码基因插入B-16黑色素瘤细胞中IFNGR2基因的第七外显子末端，使所述绿色荧光蛋白EGFP的编码基因与IFNGR2基因融合表达；所述CRIS-PITCh系统包括sgRNA表达盒；所述sgRNA的靶序列为如下(a1)或(a2)：

(a1)SEQ ID NO.1自5’端第15881-15903位；

(a2)SEQ ID NO.1自5’端第15936-15958位。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述CRIS-PITCh系统包括载体甲及载体乙；所述载体甲包括Cas9表达盒、sgRNA表达盒和PITCh sgRNA表达盒；所述载体乙包括供体片段和位于供体片段两端的同源臂；所述供体片段为如下(b1)或(b2)：

(b1)SEQ ID NO.4自5’端第1595-2974位；

(b2)SEQ ID NO.5自5’端第28-1407位。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：

位于(b1)所述的供体片段两端的同源臂为SEQ ID NO.4自5’端第1567-1586位所示的上游同源臂和SEQ ID NO.4自5’端第2975-2994位所示的下游同源臂；

或，位于(b2)所述供体片段两端的同源臂为SEQ ID NO.5自5’端第1-20所示的上游同源臂和SEQ ID NO.5自5’端第1408-1427所示的下游同源臂。

4.权利要求1至3任一所述方法制备得到的细胞系。

5.权利要求4所述细胞系在IFNGR2基因功能及表达调控机制研究中的应用。

6.权利要求4所述细胞系在靶向肿瘤免疫的药物筛选中的应用。

7.权利要求1至3中任一所述的所述sgRNA表达盒或所述CRIS-PITCh系统。

8.权利要求1至3中任一所述的sgRNA表达盒或所述CRIS-PITCh系统在制备权利要求4所述细胞系中的应用。

9.权利要求1至3中任一所述的sgRNA表达盒或所述CRIS-PITCh系统在研究IFNGR2基因功能及表达调控机制或的靶向肿瘤免疫的药物筛选中的应用。

10.权利要求1至3中任一所述的sgRNA表达盒或所述CRIS-PITCh系统在制备用于研究IFNGR2基因功及表达调控机制或的靶向肿瘤免疫的药物筛选的细胞系中的应用。