[发明专利]一种全细胞转化制备葡萄糖二酸的方法

说明书

本发明公开了一种全细胞转化制备葡萄糖二酸的方法，属于生物技术领域。以大肠杆菌为生产菌株，异源表达不同来源的葡醛酸脱氢酶，通过高密度发酵培养，获得蛋白过表达的大肠杆菌菌体细胞，以葡萄糖醛酸为底物生产葡萄糖二酸。本发明转化液成分单一，生产周期短，操作简单、生产成本低及无安全隐患等优点。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体为一种全细胞转化制备葡萄糖二酸的方法。

背景技术

葡萄糖二酸(Glucaric acid，简称GA)是一种无毒的葡萄糖衍生物，天然存在于苹果、柑橘等水果和西兰花、甘蓝等十字花科蔬菜中，在少量哺乳动物及人体内也有分泌(仇钰莹,方芳,堵国成等.葡萄糖二酸研究进展[J].生物工程学报,2015,31(4):481-490)。葡萄糖二酸被美国能源部评为“最具价值的生物炼制产品”可作为原料生产多种聚合物中间体和生物新能源(袁海波,李江华,刘龙,等.基于系统生物学和合成生物学的重要平台化学品生物制造的研究进展[J].化工学报,2016,67(21):129-139.)，也具有调节人体免疫系统、减少人体内胆固醇的含量和调节体内某些激素的含量、保护肝脏的机能、减少癌症病发可能的作用具有巨大的应用潜力和经济价值(Smith T,Denton T,Zhang J.Synthesis andcharacterization of higher molecular weight stereorandom poly(D-glucaramides)from 1:1alkylenediammonium D-glucaric acid[C].234th ACS National Meeting,Boston,M A,United States,2007,79(15):225-227.)。

目前，国内外葡萄糖二酸的制备方法主要包括硝酸氧化、TEMPO氧化和微生物发酵法，Sohst和Tollens(Sohst O,Tollens B.Crystallized saccharic acid.JustusLiebigs Annalender Chemie.Berlin:Verlag Chemie,1888,245:1–27)报道了硝酸通过控制反应程度将葡萄糖氧化成为葡萄糖二酸及小分子量有机酸。但是硝酸氧化工艺成本高、条件苛刻、能耗大、成本高、得率低且安全性差，不能用于食品、药品等领域。Kochkar H和Lassalle L(Kochkar H,Lassalle L,Morawietz M,et al.Regioselective oxidation ofhydroxyl groups of sugar and its derivatives using silver catalysts mediatedby TEMPO and peroxodisulfate in water.J Catal,2000,194(2):343–351.)报道了利用2,2,6,6-四甲基-1-哌啶氧自由基(TEMPO)介导的电化学氧化葡萄糖合成葡萄糖二酸的方法，虽然TEMPO氧化法比较温和，但是催化剂价格昂贵且不易进行大规模生产，因此微生物发酵法制备葡萄糖二酸目前也越来越受到研究者们的青睐，小西一诚(CA104080918A),在大肠杆菌共同表达啤酒酵母中的肌醇-1-磷酸合酶(Inol)，小鼠肌醇加氧酶(MIOX)和丁香假单胞菌的葡醛酸脱氢酶(Udh)，构建从葡萄糖生产葡萄糖二酸的合成途径；康振等(CN104312935A)在毕赤酵母中共同表达了毕赤酵母的肌醇-1-磷酸合酶(Inol)，肌醇加氧酶(MIOX)和臭恶假单胞菌的葡醛酸脱氢酶(Udh)，构建从葡萄糖生产葡萄糖二酸的合成途径；但是微生物发酵法生产周期长、生产得率较低且后续分离提取较为困难，因此，需要开发一种操作简便、条件温和、原料利用率高、转化率高且分离纯化成本低的葡萄糖二酸生产方法。

发明内容