[发明专利]一种基于竞争性单克隆抗体的旋毛虫病抗体检测试剂盒及其制备方法

权利要求书

1.一种基于竞争性单克隆抗体的旋毛虫病抗体检测试剂盒，其特征在于，所述旋毛虫病抗体检测试剂盒含有试纸条和竞争性检测试剂；所述试纸条包括样品垫、层析膜、吸水垫和底板，所述层析膜上设有检测线与质控线，其中检测线上喷涂有兔抗Ts-WN10多克隆抗体，质控线上喷涂有兔抗鼠IgG；所述竞争性检测试剂含有杂交瘤细胞株WN10-1H9所分泌的单克隆抗体Ts-WN10-1H9和重组抗原Ts-WN10；所述杂交瘤细胞株WN10-1H9的微生物保藏号是：CGMCC No.18316。

2.根据权利要求1所述的旋毛虫病抗体检测试剂盒，其特征在于，所述单克隆抗体标记有CdSe/ZnS量子点荧光微球。

3.根据权利要求1所述的旋毛虫病抗体检测试剂盒，其特征在于，所述样品垫材质为玻璃纤维素膜Ahistrom8964；所述层析膜材质为硝酸纤维素膜WhatmanAE99。

4.权利要求1-3任意一项所述的旋毛虫病抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)旋毛虫Ts-WN10重组抗原制备：将重组大肠杆菌BL21(DE3)-pET28a-Ts-WN10诱导表达后经Ni柱一步柱上复性纯化，获得旋毛虫Ts-WN10重组抗原；

2)竞争性单克隆抗体Ts-WN10-1H9的制备：用微生物保藏号为CGMCC No.18316的杂交瘤细胞株WN10-1H9制备小鼠腹水，收获腹水经Protein G纯化，获得竞争性单克隆抗体Ts-WN10-1H9，然后进行量子点荧光微球偶联标记；

3)CdSe/ZnS量子点荧光微球偶联竞争性单克隆抗体Ts-WN10-1H9标记物的制备：利用EDC活化微球上的羧基，活化后的羧基与步骤2）制备的单克隆抗体蛋白上的氨基结合，促使其偶联上蛋白；

4)兔抗Ts-WN10多克隆抗体的制备：用步骤1）制备得到的Ts-WN10重组抗原免疫新西兰兔，收获血清经Protein G纯化，获得兔抗Ts-WN10多克隆抗体；

5)样品的制备：将样品垫浸泡入含0.05%（体积）Tween20和0.2%（质量）BSA的0.01MPH7.4的PB缓冲液中，取出后于37℃烘干；

6)检测线和质控线的制备：将步骤4）制备的兔抗Ts-WN10多克隆抗体与兔抗鼠IgG按照10:1的质量比，分别喷涂在层析膜上，形成检测线与质控线，37℃干燥2-3 h，密封保存备用；

7)试纸条的组装：在底板上沿样品检测时的层析方向依次将样品垫、层析垫、吸水垫粘贴在底板上，制成试纸条。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤1）中所述旋毛虫Ts-WN10重组抗原的制备方法如下：将Ts-WN10基因经EcoRI和XhoI双酶切后连接到经同样双酶切后的表达载体pET28a中，所述Ts-WN10基因登录号为EU263325，得到的连接产物转化大肠杆菌BL21（DE3），获得重组菌BL21(DE3)-pET28a-Ts-WN10，重组菌经IPTG诱导表达后，经Ni柱纯化得到可溶性蛋白，即为旋毛虫Ts-WN10重组抗原。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述旋毛虫Ts-WN10重组抗原的制备方法为，将重组菌BL21(DE3)-pET28a-Ts-WN10加入到LB培养基中37℃震荡培养至OD_600nm值为0.5-1时，加IPTG至终浓度为1mmol/L，37℃诱导6-8h，诱导后菌液离心后用20mM Tris-HCL重悬缓冲液重悬，离心后取沉淀，用预冷的包涵体洗涤液重悬，离心收获沉淀，此步骤重复3次；离心收获的沉淀用预冷的含尿素的PBS洗涤液重悬，离心收获沉淀，此步骤重复2次；离心收获沉淀用结合缓冲液重悬，4℃溶解过夜，离心收上清，上清过滤后纯化得到旋毛虫Ts-WN10重组抗原。