[发明专利]一种检测胰腺癌患者外周血循环肿瘤细胞PD-L1表达的免疫荧光试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种检测胰腺癌患者外周血循环肿瘤细胞PD-L1表达的免疫荧光试剂盒，其特征在于，包括稀释液45mL，脱色液1mL，染色液A 0.5mL，染色液B 1mL，200μl 甲醇、200μl 2%PFA，100μl10%山羊血清，小鼠抗CK、大鼠抗CD45和兔抗PD-L1组成的一抗混悬液100μl，荧光标记的羊抗小鼠、荧光标记的羊抗大鼠、荧光标记的羊抗兔组成的二抗混悬液100μL，DAPI封片剂；

一抗混悬液中小鼠抗CK、大鼠抗CD45和兔抗PD-L1分别按1:100、1:400和1:500稀释，总体积为100μL；

二抗混悬液中荧光标记的羊抗小鼠、荧光标记的羊抗大鼠、荧光标记的羊抗兔按1:500稀释。

2.根据权利要求1所述的免疫荧光试剂盒，其特征在于，所述稀释液包括：含量为0.5g/L的乙二胺四乙酸盐，含量为6g/L的硫酸钠；含量为4g/L的氯化钠，含量为2g/L的二羟基甲基脲，含量为6g/L的羟乙基哌嗪乙硫磺酸；含量为0.5g/L的十二烷基磺基甜菜碱，含量为0.5g/L的叠氮钠，含量为0.3g/L的聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物，其余是水。

3.根据权利要求1所述的免疫荧光试剂盒，其特征在于，所述脱色液是由乙醇与醋酸按体积比1:2组成。

4.根据权利要求1所述的免疫荧光试剂盒，其特征在于，所述染色液A为DAB染色液；所述染色液B为苏木素染色液。

5.一种利用权利要求1-4任一项所述的免疫荧光试剂盒非诊断目的检测胰腺癌患者外周血循环肿瘤细胞PD-L1表达的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）利用膜过滤装置分离获取无法获得组织标本的晚期或复发胰腺癌患者外周血中的CTC：采集无法获取组织标本的晚期或复发胰腺癌患者外周血：肘正中静脉外周血5ml；

（2）外周血样预处理：将采集的外周血样采用稀释液45ml进行稀释，稀释后加多聚甲醛固定外周血样10分钟，固定终浓度为0.25%；

（3）利用膜过滤分离肿瘤细胞装置过滤外周血样，分离获得外周血CTC：将预处理的外周血样加入到膜过滤分离肿瘤细胞装置的血样容器中，使其依靠重力自然过滤；

（4）过滤结束后，从膜过滤分离肿瘤细胞装置中取下滤器，将循环肿瘤细胞染色液A液0.5ml加入到滤器中，染色3min，PBS缓冲液冲洗干净；滤液过滤完全后加入染色液B液1ml，染色2min，纯水1ml冲洗2次；

（5）向滤器中加入200μl 2%PFA，室温固定5min，完成后0.5ml PBS漂洗3次，每次2min；

（6）再向滤器中加入200μl预冷的甲醇，4℃固定15min，取下滤膜，放置在载玻片上，干燥后在显微镜下观察，确定是否存在CTC；

（7）运用免疫荧光方法检测外周血CTC的PD-L1表达情况。

6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述步骤（7）所述检测CTC的PD-L1表达的具体方法如下：

S1脱色：将带有CTC的滤膜从载玻片上取下，置于脱色液中浸泡4-6小时，脱去CTC染色液；

S2封闭：羊血清用PBS稀释，向滤膜上滴加100μl 10%山羊血清，室温放置30min，完成后吸去多余的血清；

S3 一抗孵育：向滤膜上滴加100μl小鼠抗CK、大鼠抗CD45和兔抗PD-L1组成的一抗混悬液，37℃孵育1h或4℃过夜，完成后PBS洗3min×3次；

S4二抗孵育：向滤膜上滴加100μl荧光标记的羊抗小鼠、荧光标记的羊抗大鼠、荧光标记的羊抗兔组成的二抗混悬液，室温孵育30min，完成后PBS洗2min×3次；

S5使用含DAPI的封片剂封片，阅片，采图；

S6采图完成后，脱片后进行瑞氏吉姆萨染色，与IF结果进行对比。