[发明专利]靶向AQP4基因的RNA干扰表达载体构建及应用

说明书

本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及靶向AQP4基因的RNA干扰表达载体构建及应用。本发明提供一种靶向大鼠AQP4基因的RNA干扰表达载体，包括根据大鼠AQP4基因序列设计的能够产生干扰AQP4蛋白表达的siRNA的DNA片段；本发明还提供构建上述载体的方法：根据AQP4的mRNA设计出siRNA的正义链和反义链，中间以10个脱氧核苷酸所形成的环结构相连，后面接有RNA polyⅢ聚合酶转录中止位点，同时模板两端分别设计BamH Ⅰ和Xho Ⅰ酶切点，将设计好的siRNA合成双链DNA序列，与载体连接即可得靶向AQP4基因的RNA干扰表达载体。本发明所构建的载体可以应用于制备治疗大鼠脑损伤的制剂及应用于研究AQP4在机体疾病发生中的作用。

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及靶向AQP4基因的RNA 干扰表达载体构建及应用。

背景技术

水通道蛋白(aquaporins，AQPS)是一组与水的通透性有关的蛋白，其中AQP1最早被发现，随后又陆续发现了包括AQP0-AQP12 在内的13种水通道蛋白，其中AQP1、AQP3、AQP4、AQP5、AQP8 和AQP9主要存在于哺乳动物的脑组织中，尤以AQP4的存在及表达最为重要，参与了脑水肿及多种神经系统疾病的发展。大量研究表明， AQP4表达升高是颅脑创伤引起脑水肿的主要原因，通过检测颅脑创伤后脑脊液中AQP4的水平，可以有效地评估脑水肿的严重程度。

诸多研究表明，AQP4的表达在细胞毒性脑水肿时起正向作用，而在血管源性脑水肿时却起反向作用。细胞毒性脑水肿时，血脑屏障未受到破坏，水分子通过AQP4进入脑组织，所以当AQP4的表达升高时，进入脑组织的水分就越多，造成的脑水肿就越严重。Papadopoulos等^[1]提出，血管源性脑水肿时，AQP4的表达上调减轻了脑水肿的程度。这可能是因为破坏了血脑屏障，血清蛋白与等渗液为了适应流体静力压的变化而渗透到细胞间隙，造成细胞间隙的肿胀。因此血管源性脑水肿的形成没有AQP4的参与，但其发展过程中水分子的排出需要AQP4作为介导。所以AQP4在此过程中对脑水肿起到了抑制作用。

Karmacharya等^[2]研究发现，在大鼠脑水肿模型中施加低强度超声波刺激，可以减少AQP4的局部聚集，与对照组比较可以明显减少脑组织含水量以及AQP4的表达。其他方面如：亚低温治疗、去骨瓣减压、地塞米松等治疗方法均能通过抑制AQP4的表达减轻脑水肿，改善预后，提高其生存率。由此推测，以AQP4作为治疗靶点来减轻各种原因导致的脑水肿是切实可行的。

目前来说，对于AQP4的研究已经不仅仅局限于其对水的转运作用，而是面向更多的研究方向。Ishiyama等^[3]发现，梅尼埃病可以特异性的改变AQP4在支持细胞和线粒体蛋白的表达，因此通过检测 AQP4表达量的变化对梅尼埃病的诊断具有极其重要的意义。Yasui^[4]发现，AQP4在类淋巴系统紊乱过程中起到了关键作用，而未来通过研制抗AQP4药物就可以更好的治疗由于类淋巴系统通路功能紊乱导致的各种神经功能退化疾病及精神疾病。除此之外，AQP4还参与诸如脑部炎性疾病、视神经脊髓炎、阿尔茨海默病等等疾病的病理过程，本文在此不再一一详述。目前关于AQP4的基础研究虽然取得了很多的成就，但其临床转化率仍然较低，针对于以AQP4作为靶点在临床疾病的诊断治疗中的研究还少有报道，在今后的研究中，可以将 AQP4更加的向临床靠近，研发出针对AQP4的治疗药物及诊断方法。