[发明专利]一种通用型供临床多次回输异体DNT细胞的高效体外扩增方法

说明书

本发明涉及一种通用型供临床多次回输异体DNT细胞的高效体外扩增方法。在本发明的方法中，在连续培养过程中分阶段递减T细胞活化剂的用量，而无需额外添加白细胞介素‑4或AB血清。使用本发明方法所获得的通用型DNT细胞，具有纯度高、体外杀瘤活性高、可复苏培养、可多次回输或可用于多位患者使用的显著优势，具有较大的临床应用前景。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种通用型供临床多次回输异体DNT细胞的高效体外扩增方法。

背景技术

免疫细胞治疗是一种新兴的、具有显著疗效的肿瘤治疗模式，是一种免疫抗癌的新型治疗方法。它是运用生物技术和生物制剂对从病人或健康捐赠者体内采集的免疫细胞进行体外培养和扩增后回输到病人体内的方法，用以激发、增强机体自身免疫功能，从而达到治疗肿瘤目的。

免疫细胞治疗是许多危及人类严重疾病的重要治疗手段，包括癌症、自身免疫疾病、器官移植排斥反应、严重过敏性疾病，甚至严重病毒感染都有使用免疫细胞治疗成功的案例。

目前免疫细胞治疗大多是采集自体免疫细胞于体外培养扩增，然后进行回输。如果需要多次回输治疗，则要多次采集人外周血中的免疫细胞进行培养扩增，才能满足临床回输需求。。由于病情严重，多数需要治疗的患者常无法提供足够数量的免疫细胞进行培养，且患者由于患病体质和各种用药治疗，导致免疫细胞在体外培养扩增非常困难，甚至无法培养。

因此，本领域需要一种从健康捐赠者获取免疫细胞且可用于多次回输的通用型免疫细胞体外扩增方法，方便临床治疗使用并避免多次采集-多次回输给临床带来的不便，同时消除由于肿瘤病人外周血质量不高甚至存在肿瘤细胞的风险。

发明内容

本发明的目的就是提供一种全新的通用型供临床多次回输异体DNT细胞的高效体外扩增方法。

在本发明的第一方面，提供了一种通用型DNT细胞的体外扩增方法，其特征在于，包括步骤：

(i)提供一获自供体的外周血起始样品I；

(ii)去除起始样品中的CD4⁺和CD8⁺T细胞，从而获得样品II；

(iii)在含有适合DNT细胞生长的培养基的培养体系中，培养样品II，从而获得样品III；其中，所述培养体系中包括固定的T细胞促分裂原；

(iv)在含有适合DNT细胞生长的培养基的培养体系中，培养样品III，从而获得样品IV；其中，所述培养基中含有浓度为30-80ng/mL(较佳地40-60ng/mL，更佳地50ng/mL)的可溶性T细胞促分裂原；

(v)在含有适合DNT细胞生长的培养基的培养体系中，培养样品IV，其中，所述培养基中含有浓度为15-40ng/mL(较佳地20-30ng/mL，更佳地25ng/mL，更佳地为亚步骤(va)中所述T细胞促分裂原的添加量的1/2)的可溶性T细胞促分裂原，从而获得所需量的通用型DNT细胞，为样品V；和

(vi)在含有适合DNT细胞保存的溶液体系中，收集样品V；其中，所述溶液中含有人血白蛋白，从而获得临床使用的通用型DNT细胞，为DNT细胞制剂；

其中，所述步骤(iii)至(v)的培养体系中均含有200-1000IU/mL(较佳地为300-700IU/mL，更佳地为500IU/mL)的重组人白介素2，并且均不含有重组人白介素4，并且均不含AB血清。

在另一优选例中，所述步骤(i)中，所述的供体是健康供体。

在另一优选例中，所述样品I的量为10-300ml，优选地为20-200ml。

在另一优选例中，所述样品II是冻存后复苏的细胞溶液。