[发明专利]一种树突状细胞负载legumain蛋白治疗肝癌的新方法

说明书

本发明公开了一种树突状细胞负载legumain蛋白治疗肝癌的新方法，疫苗使用DC细胞负载legumain蛋白制备；树突状细胞负载legumain蛋白疫苗的注射方式为：细胞混悬液，经X射线血液辐照仪照射，3Gy/min，照射1min；混悬液，通过尾静脉注射回输机体体内。本发明的有益之处在于：利用体外培养DC，然后通过legumain特异性抗原的刺激，同时通过X射线辐照的方式，消除机体异常的免疫应答，然后回输机体体内，进而唤醒免疫细胞的记忆，达到治疗肿瘤的目的；通过联合手术和放化疗，对于微小组织以及残余组织的清除，对于防止肿瘤复发和转移，具有较大的应用价值。

技术领域

本发明涉及一种蛋白治疗肝癌的新方法，具体涉及一种树突状细胞负载legumain蛋白治疗肝癌的新方法，属于医药技术领域。

背景技术

哺乳动物免疫系统分为两个部分，一部分是固有免疫应答系统，另一部分是适应性免疫应答系统，两者不是孤立的，而是形成一个统一的整体。

当外界的病原微生物或机体自身细胞发生凋亡时所释放的成分刺激机体，固有免疫系统首先发挥作用。当人体的固有免疫系统，不足以应付体外的刺激或者体内的变异时，就要根据外界抗原的性质，刺激量以及刺激强度，同时权衡自身的免疫状况，来决定和调控是否启动适应性免疫应答。抗原提呈细胞，包括巨噬细胞和树突状细胞(dendritic cells,DC)等，便是连接固有免疫和适应性免疫应答的桥梁。

DC是功能最强的抗原提呈细胞(Antigen Presenting Cells,APC)，通过自身表达的某些分子，决定免疫应答的类型和强度，尤其是其成熟状态与否，直接影响机体的免疫平衡。成熟DC(Mature DC,mDC)能有效提呈抗原、激活初始T细胞、启动适应性免疫应答；未成熟DC(Immature DC,imDC)则不能启动适应性免疫应答，甚至引发机体免疫耐受。

Legumain又称天冬酰胺内肽酶(AEP)，是一种溶酶体半胱氨酸蛋白酶，其基因定位于14号染色体，与动脉粥样硬化，脑退行性变，肝脏纤维化，抗原加工处理等过程密切相关，同时，在机体乳腺癌，结肠癌，前列腺癌，卵巢癌等多种恶性肿瘤中高表达，而在正常组织中，不表达或者表达水平极低。Legumain的表达程度能够增强肿瘤细胞的运动，增殖和迁移能力，具有一定的肿瘤特异性。

肿瘤疾病的发生和发展，其根本原因是，机体的固有免疫系统，特别是适应性免疫系统，无法识别变异的细胞，导致细胞异常增殖，其增殖的数量，超过机体承受的限度，就会导致肿瘤发生。

所以，我们设想选择高敏感度的抗原，在体外触发机体的免疫系统，在实际的肿瘤治疗中，具有一定的可行性，特别是对于手术，放化疗后的患者，能够清除微小肿瘤残灶，进而最大程度防止复发和转移方面，具有一定的治疗价值。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种树突状细胞负载legumain蛋白治疗肝癌的新方法。

为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：

一种树突状细胞负载legumain蛋白疫苗，使用DC细胞负载legumain蛋白制备。

优选的DC细胞培养步骤包括：

步骤一：小鼠眼球取血，置于EDTA抗凝管中；44

步骤二：Ficoll淋巴细胞分离液和生理盐水1：1混合，配制成单个核细胞提取液，放于离心管中；

步骤三：将EDTA抗凝的全血缓慢加入单个核细胞提取液表面，离心后分为三层；

步骤四：用移液器，轻轻吸取中间层，用RPMI-1640基础培养基洗涤两遍，调整细胞浓度为1×10⁶/mL，置于RPMI-1640基础培养基中，温箱中孵育2～3h，用预温的RPMI1640液轻轻冲刷细胞，洗去未贴壁的细胞，吸取基础培养基；