[发明专利]一种树突状细胞负载legumain蛋白治疗肝癌的新方法

权利要求书

1.一种树突状细胞负载legumain蛋白疫苗，其特征在于，所述树突状细胞疫苗的制备使用DC细胞负载legumain蛋白。

2.根据权利要求1所述的树突状细胞负载legumain蛋白疫苗，其特征在于，DC细胞培养步骤包括：

步骤一：小鼠眼球取血，置于EDTA抗凝管中；

步骤二：Ficoll淋巴细胞分离液和生理盐水1：1混合，配制成单个核细胞提取液，放于离心管中；

步骤三：将EDTA抗凝的全血缓慢加入单个核细胞提取液表面，离心后分为三层；

步骤四：用移液器，轻轻吸取中间层，用RPMI-1640基础培养基洗涤两遍，调整细胞浓度为1×10⁶/mL，置于RPMI-1640基础培养基中，温箱中孵育2～3h，用预温的RPMI1640液轻轻冲刷细胞，洗去未贴壁的细胞，吸取基础培养基；

步骤五：加入X-Vivo无血清培养基，包含IL-4，GM-CSF,青链霉素，放入温箱中继续培养，此时定为细胞培养的第0d，以后，隔日半定量换液，轻轻摇动培养板，防止细胞凝集，在细胞培养的第6d收集细胞。

3.根据权利要求2所述的树突状细胞负载legumain蛋白疫苗，其特征在于，DC细胞培养步骤四中，温箱条件为37℃、5％CO₂、饱和湿度。

4.根据权利要求1所述的树突状细胞负载legumain蛋白疫苗，其特征在于，legumain蛋白提取和纯化步骤包括：

步骤一：处死小鼠，取出小鼠肝脏，切除肿瘤组织，进行免疫组化筛查，确认legumain高表达；

步骤二：切除1g左右的肿瘤组织，置于生理盐水中，充分剪碎肿瘤组织，加入2-3倍Tris-NH4CL裂解液，充分匀浆，过滤，获得匀浆液，在低温离心机高速离心，收集上清液，进一步滤网过滤，去掉大的杂质，收集过滤后的液体；

步骤三：加入含有Sepharose 6B的层析过滤柱预平衡，加入样品，用缓冲液、NaCl溶液进行洗涤，再用SDS，对层析柱最后洗涤，收集有蛋白流出的截段，置于聚乙二醇溶液中，进一步浓缩；

步骤四：将1μg相应的Anti-legumain抗体和10-50μl protein A/G-beads混合，加入到步骤四得到的浓缩液中，在4℃缓慢摇晃孵育过夜；

步骤五：将步骤五所获得的溶液离心，将proteinA/G-beads离心至管底；去掉上清液，legumain蛋白和附着于ProteinA/G柱子上的抗体相结合；加入20uL的SDS缓冲液，冲洗，然后沸水煮10min；得到的缓冲液低温真空干燥，即为legumain蛋白样品。

5.根据权利要求4所述的树突状细胞负载legumain蛋白疫苗，其特征在于，legumain蛋白提取和纯化步骤中步骤二的离心条件为4℃，25,000rpm，3小时。

6.根据权利要求4所述的树突状细胞负载legumain蛋白疫苗，其特征在于，legumain蛋白提取和纯化步骤中步骤三的Sepharose 6B层析过滤柱中包含20mmol/L，pH＝7.2的Tris溶液，然后加入样品，缓冲液是20mmol/L的Tris溶液，NaCl溶液是溶度为1mmol/L,pH值为8.5。

7.根据权利要求1所述的树突状细胞负载legumain蛋白疫苗，其特征在于，DC细胞负载legumain蛋白的步骤为：

步骤一：收集培养6天树突状细胞，镜下观察状态良好；

步骤二：按照10⁴细胞：1ng的比例，加入legumain蛋白，然后两者共培养4h，镜下观察，加入100ml浓度为5％的糖盐水，制成细胞混悬液。

8.一种权利要求1所述的树突状细胞负载legumain蛋白疫苗的使用方法，其特征在于，注射方式为：细胞混悬液，经X射线血液辐照仪照射，3Gy/min，照射1min；混悬液，通过尾静脉注射回输机体体内。

9.如权利要求1至7任一所述的树突状细胞负载legumain蛋白疫苗和权利要求8所述的树突状细胞负载legumain蛋白疫苗的使用方法在肝癌治疗中的应用。