[发明专利]一种富集N-磷酸化蛋白的方法

说明书

一种富集N‑磷酸化蛋白的方法，涉及蛋白质富集。利用一种连接有双官能团连接剂的磁性纳米粒子固定功能蛋白，并在交联剂的作用下交联底物蛋白，达到富集磷酸化蛋白的目的。包括步骤：1)合成双官能团连接剂H₂N‑CH_2‑CH₂‑S‑S‑CH₂‑CH₂‑COOH；2)磁性纳米颗粒上羧基‑COOH的活化：3)磁性纳米颗粒与连接剂的连接；4)连接剂上羧基‑COOH的活化；5)磷酸化激酶McsB蛋白的连接；6)多聚甲醛交联磷酸化激酶McsB及其底物蛋白CtsR；7)将富集的蛋白与磁性纳米粒子的分离。原材料简单易得，交联时间短，操作简便，分离过程中不需要高速离心机的使用，整个过程在室温下即可完成。

技术领域

本发明涉及蛋白质富集，尤其是涉及一种富集N-磷酸化蛋白的方法。

背景技术

磁性纳米粒子与磁性分离技术的结合广泛应用于生物分子的富集和分离。磁性纳米粒子经过适当的表面修饰，可高度选择性地结合目标蛋白，在解决蛋白质的快速分离及高特异性的选择性分离方面具有较高优势。由于N-磷酸化修饰具有酸、热不稳定性、天然丰度低等特性，一直缺乏有效的富集和研究工具，但其在生物体内的作用又十分重要，因此需要开发一种新的简便富集方法，以便后续对N-磷酸化蛋白进行更深入的研究。

目前传统的磷酸化多肽的富集最常用的方法有：

(1)固定金属离子亲和色谱(immobilized metal affinity chromatography，IMAC)：通过把带正电荷的金属离子如Fe(III)或Ga(III)等金属离子螯合在固相硝基三乙酸/亚胺二乙酸树脂上，带负电荷的磷酸根通过静电作用会吸附到树脂中，以此达到富集的目的[如Potel C M,Lin M H,Heck A J R,et al.Widespread bacterial proteinhistidine phosphorylation revealed by mass spectrometry-based proteomics[J].Nat.Methods,2018,15(3):187-190.]。

(2)金属氧化物亲和色谱(metal oxide affinity chromatography，MOAC)：基于磷酸基团与金属氧化物(如TiO2、Al2O3、Fe3O4和SnO2等)之间的亲和能力实现对磷酸化肽段的富集，一般通过Lewis酸碱之间的相互作用，磷酸基团与金属氧化物形成二齿配体，以此达到富集的目的[如Leitner A.Phosphopeptide enrichment using metal oxideaffinity chromatography[J].Trends Anal.Chem.,2010,29(2):177-185.]。

(3)离子交换色谱(ion exchange chromatography，IEC)：多肽通过带正电荷的侧链基团与带负电荷的柱状树脂相互作用而保留在柱子上，等电点不同的多肽可以在柱子上依次洗脱下来。磷酸基团在低pH下的负电荷性质导致磷酸化肽段对负电荷树脂的亲和力低于相同序列的相应非磷酸化肽段，因此磷酸化的多肽首先被洗脱下来，以此达到富集的目的。[如Wolters D A,Washburn M P,Yates J R.An automated multidimensionalprotein identification technology for shotgun proteomics[J].Anal.Chem.,2001,73(23):5683-5690.]。