[发明专利]一种富集N-磷酸化蛋白的方法

权利要求书

1.一种富集N-磷酸化蛋白的方法，其特征在于包括以下步骤：

1）合成双官能团连接剂H₂N-CH_2-CH₂-S-S-CH₂-CH₂-COOH；将3-巯基丙酸、2-氨基乙硫醇盐酸盐溶液和双氧水混合，室温下反应，即得双官能团连接剂；

2）磁性纳米颗粒上羧基-COOH的活化：取四氧化三铁纳米颗粒悬液，PBS缓冲液洗涤后重悬于PBS缓冲液中，再加入活化剂混匀反应，然后用PBS缓冲液洗涤以除去多余的反应物，得活化后的四氧化三铁纳米颗粒悬液；

3）磁性纳米颗粒与连接剂的连接，即磁珠表面的氨基化；向步骤2）活化后的四氧化三铁纳米颗粒悬液中，加入步骤1）中合成的双官能团连接剂，室温下混匀反应，使连接剂上的-NH₂与磁珠上的-COOH连接，得到连好连接剂的四氧化三铁溶液；

4）连接剂上羧基-COOH的活化；向步骤3）连好连接剂的四氧化三铁溶液中加入活化剂，室温下混匀反应，磁分离后吸出上清液，使PBS缓冲液洗涤以除去多余的反应物，完成连接剂上羧基的活化；

5）磷酸化激酶McsB蛋白的连接：向步骤4）所得溶液中加入磷酸化激酶McsB蛋白，反应后获得连接好磷酸化激酶McsB蛋白的磁性纳米颗粒；

6）多聚甲醛交联磷酸化激酶McsB及其底物蛋白CtsR：向连接好McsB的磁性纳米颗粒中加入终浓度5%的多聚甲醛和底物蛋白CtsR，混匀反应后再加入甘氨酸溶液终止反应；

7）将富集的蛋白与磁性纳米粒子的分离：外加磁场使磁珠从溶液中分离，用PBS缓冲液洗涤后，向磁珠中加入终浓度0.5～1 M的 DTT，反应后使连接剂上的二硫键S-S断裂，再次磁分离，富集到的N-磷酸化蛋白存在于上清液中，即完成富集N-磷酸化蛋白。

2.如权利要求1所述一种富集N-磷酸化蛋白的方法，其特征在于在步骤1）中，所述将3-巯基丙酸、2-氨基乙硫醇盐酸盐溶液和双氧水混合是将1.13g 3-巯基丙酸、0.87mL 2-氨基乙硫醇盐酸盐溶液和16%双氧水混合。

3.如权利要求1所述一种富集N-磷酸化蛋白的方法，其特征在于在步骤2）中，所述取四氧化三铁纳米颗粒悬液，PBS缓冲液洗涤后重悬于PBS缓冲液中是取100 μL四氧化三铁纳米颗粒悬液，PBS缓冲液洗涤三次后重悬于1mL PBS缓冲液中；所述四氧化三铁纳米颗粒的粒径为70～300nm。

4.如权利要求1所述一种富集N-磷酸化蛋白的方法，其特征在于在步骤2）中，所述活化剂采用1.9～9.5 mg EDC和2.1～10.5 mg NHSS溶于100μL PBS缓冲液；所述反应的时间为1h；所述PBS缓冲液洗涤是洗涤3遍。

5.如权利要求1所述一种富集N-磷酸化蛋白的方法，其特征在于在步骤3）中，所述反应的时间为2h。

6.如权利要求1所述一种富集N-磷酸化蛋白的方法，其特征在于在步骤4）中，所述活化剂为1.9～9.5 mg EDC和2.1～10.5 mg NHSS溶于100μL PBS缓冲液；所述反应的时间为1h。

7.如权利要求1所述一种富集N-磷酸化蛋白的方法，其特征在于在步骤4）中，所述磁分离采用放置于磁力架进行磁分离；所述PBS缓冲液洗涤是洗涤3遍。

8.如权利要求1所述一种富集N-磷酸化蛋白的方法，其特征在于在步骤5）中，向100μL反应步骤4）所得的溶液中，继续加入500μL纯化获得的McsB蛋白；所述反应是于常温下摇匀反应2h；所述连接好磷酸化激酶McsB蛋白的磁性纳米颗粒是1mg磁珠表面的酸化激酶McsB蛋白连接量为0.26mg。