[发明专利]一种基于检测核酸hly与乙偶姻的双功能传感器检测单增李斯特菌的方法

说明书

本发明公开了一种基于检测核酸hly与代谢标志物乙偶姻的双功能传感器检测单增李斯特菌的方法，步骤是(1)基于检测单增李斯特菌核酸和代谢标志物的双功能传感器制备；(2)双功能传感器标定或校准；(3)以牛奶样品为例，基于双功能传感器利用加标回收方法检测牛奶中单增李斯特菌浓度。本发明将检测不同标志物的方法集中于单一平台中，利用一个双功能传感器实现对单增李斯特菌不同标志物的同时检测和相互印证，增强了检测准确性，同时本发明方法将国标GB 4789.30‑2016中大约2～5天的单增李斯特菌鉴定时间缩短为约1.5小时，省时省功，具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明涉及一种检测单增李斯特菌的方法，尤其涉及一种基于检测核酸hly与代谢标志物乙偶姻的双功能传感器检测单增李斯特菌的方法。属于电化学分析测试领域。

背景技术

单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)，简称单增李斯特菌，是一种革兰氏阳性细菌，1926年在一种影响兔子和豚鼠的疾病中首次对该菌进行了描述。它在20世纪70年代被认为是一种人类疾病的发病因素，随后在80年代被确定为一种食源性病原体。李斯特菌病是一种由摄入受单增李斯特菌污染的食物引起的疾病，主要影响免疫功能低下的患者、孕妇和新生儿。在摄入受污染的食物后，单增李斯特菌会穿过肠屏障、血脑屏障和胎盘屏障，引起胃肠炎、脑膜炎、败血症、流产、妊娠并发症等。此外，单增李斯特菌可耐受较极端环境，如较宽的温度范围(1～45℃)、较宽的pH范围(4.5～9.6)、高盐浓度(10％～15％)等，这些特性使得单增李斯特菌可以与不同病原微生物共存于不同类型食物中，严重危害人类健康。因此，可靠、灵敏、准确地检测食品中的单增李斯特菌对预防感染具有重要意义。

近几十年的广泛研究提供了多种对单增李斯特菌的检测方法。其中基于分离培养的方法被誉为单增李斯特菌检测的“金标准”。但该方法需要研究人员具备一定的专业技能，且鉴定步骤相当耗时(需2～5天)、繁琐(包括动力学实验、过氧化氢酶测试、糖发酵和溶血性实验等)。鉴于分离培养检测方法的缺点，研究人员又开发了许多较为快速的检测方法，如酶联免疫吸附测定(ELISA)、DNA杂交和实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)等。这些基于单增李斯特菌的单标志物(抗原或标志基因)检测的方法虽然可以快速检测单增李斯特菌，但是也存在假阳性或假阴性概率。为此，检验人员通常需要单一检测方法重复多次，或者不同检测方法联用来增强对单增李斯特菌检测的准确性。然而，随着检测准确性的提升，也相应产生了许多问题，如较长的鉴定周期、不同方法需要各种昂贵的仪器设备以及非实验室场景使用受限等。基于此，建立一种准确、简单、特异、快速的分析手段来检测食品中的单增李斯特菌具有重要现实意义和市场需求。

发明内容

针对现有检测单增李斯特菌方法的不足，本发明要解决的问题是提供一种基于检测单增李斯特菌核酸标志物hly与代谢标志物乙偶姻的双功能传感器检测单增李斯特菌的方法。

本发明所述基于检测核酸hly与乙偶姻的双功能传感器检测单增李斯特菌的方法，步骤是：

(1)基于检测单增李斯特菌核酸和代谢标志物的双功能传感器制备；

(2)双功能传感器标定或校准；

(3)以牛奶样品为例，基于双功能传感器利用加标回收方法检测牛奶中单增李斯特菌浓度；

其特征在于：

步骤(1)所述基于检测单增李斯特菌核酸和代谢标志物的双功能传感器制备方法是：

1)制备纳米多孔金(NPG)/玻碳电极(GCE)：将厚度为100±10nm的Au/Ag合金片置于浓硝酸中，在40±2℃温度下，腐蚀1小时，制得纳米多孔金薄膜，将制得的纳米多孔金薄膜固定在玻碳电极表面，真空干燥1～2小时后制得NPG/GCE电极；