[发明专利]一种基于检测核酸hly与乙偶姻的双功能传感器检测单增李斯特菌的方法

权利要求书

1.一种基于检测核酸hly与乙偶姻的双功能传感器检测单增李斯特菌的方法，步骤是：

(1)基于检测单增李斯特菌核酸和代谢标志物的双功能传感器制备；

(2)双功能传感器标定或校准；

(3)以牛奶样品为例，基于双功能传感器利用加标回收方法检测牛奶中单增李斯特菌浓度；

其特征在于：

步骤(1)所述基于检测单增李斯特菌核酸和代谢标志物的双功能传感器制备方法是：

1)制备纳米多孔金(NPG)/玻碳电极(GCE)：将厚度为100±10nm的Au/Ag合金片置于浓硝酸中，在40±2℃温度下，腐蚀1小时，制得纳米多孔金薄膜，将制得的纳米多孔金薄膜固定在玻碳电极表面，真空干燥1～2小时后制得NPG/GCE电极；

2)制备ssDNA/NPG/GCE电极：将与hly基因部分互补且末端修饰有巯基的捕获探针ssDNA溶于超纯水中，制得浓度为0.5～3μM的ssDNA溶液，然后将NPG/GCE电极浸入ssDNA溶液，在4℃孵育48～72小时后制得ssDNA/NPG/GCE电极；其中所述捕获探针ssDNA的序列为5’-TGGCGGCACATTTGTCACTGCA-(CH2)₃-SH-3’；

3)制备双功能传感器BSA/ssDNA/NPG/GCE电极：将制得的ssDNA/NPG/GCE电极与浓度为m/v是0.5～5％的牛血清白蛋白(BSA)在4～30℃下孵育15～30分钟，制得基于检测单增李斯特菌核酸和代谢标志物的双功能传感器BSA/ssDNA/NPG/GCE电极；

步骤(2)所述双功能传感器标定或校准的方法是：

1)核酸标志物hly检测：将培养好的浓度为10⁴～10⁹CFU mL^-1的单增李斯特菌液，按不同浓度各取1～10mL，再以20～60千赫兹频率超声破碎细胞以及长链核酸，并与BSA/ssDNA/NPG/GCE电极在20～30℃孵育5～30分钟，制得hly/BSA/ssDNA/NPG/GCE电极；将hly/BSA/ssDNA/NPG/GCE电极与5～40μM简称MB的亚甲基蓝在20～30℃孵育5～30分钟制得MB/hly/BSA/ssDNA/NPG/GCE电极；将MB/hly/BSA/ssDNA/NPG/GCE电极作为工作电极，以铂电极为对电极，以饱和甘汞电极为参比电极，放入50mM磷酸盐缓冲液的反应体系中，利用线性扫描伏安法，以20～100mV s^-1的扫速在-0.5～+0.1V电压范围内检测，将得到的MB峰电流密度值对单增李斯特菌浓度作图，得到线性标准曲线；

2)代谢标志物乙偶姻检测：首先建立乙偶姻浓度对NADH降低量线性关系，将乙偶姻按0～500μM的不同浓度分别加入含有1～5mM NADH的50mM磷酸盐缓冲液反应体系中，以BSA/ssDNA/NPG/GCE电极作为工作电极，以铂电极为对电极，以饱和甘汞电极为参比电极，利用线性扫描伏安法，以20～100mV s^-1的扫速在+0.1～+0.7V电压范围内检测，将得到的NADH初始峰电流值作为对照，即j_NADH对照；然后在缓冲体系中加入1～5mg异源表达的乙偶姻还原酶，在20～30℃反应5～30分钟，然后以BSA/ssDNA/NPG/GCE电极作为工作电极，利用线性扫描伏安法，以20～100mV s^-1的扫速在+0.1～+0.7V电压范围内检测，将得到的反应后的NADH峰电流值记做j_NADH反应，将j_NADH对照减去j_NADH反应，得到Δj，将检测不同浓度乙偶姻得到的Δj对乙偶姻浓度作图，得到乙偶姻浓度线性标准曲线；然后建立乙偶姻浓度对单增李斯特菌浓度线性关系，取1～50mL培养好的浓度为8.0×10⁵～3.5×10⁹CFU mL^-1的单增李斯特菌液，以4000～8000rpm离心不同浓度菌液，收集培养基上清，加入50mM磷酸盐缓冲液反应体系，同时该体系加入终浓度为1～5mM的NADH，按照建立乙偶姻浓度对NADH降低量线性关系方法检测不同浓度单增李斯特菌上清中所含乙偶姻浓度，绘制乙偶姻浓度对单增李斯特菌浓度线性标准曲线；

步骤(3)所述以牛奶样品为例，基于双功能传感器利用加标回收方法检测牛奶中单增李斯特菌浓度的方法是：

取25mL成品牛奶加入到225mL适于单增李斯特菌生长的培养基中，命名为溶液1；从溶液1中取出0.1mL加入到10mL适于单增李斯特菌生长的培养基中，命名为溶液2；溶液2中加入适量的单增李斯特菌并使得菌的终浓度为10⁴CFU mL^-1，在37℃培养6小时、9小时和12小时，利用步骤(1)制备的BSA/ssDNA/NPG/GCE电极按照步骤(2)中所述方法对单增李斯特菌核酸标志物和代谢标志物进行检测，将得到的峰电流值分别带入不同的线性标准曲线中即可相应得到单增李斯特菌的浓度。