[发明专利]一种STED超分辨图像背景噪声差分抑制方法

说明书

本发明公开了一种STED超分辨图像背景噪声差分抑制方法。所述的STED超分辨图像背景噪声差分抑制方法通过获取STED超分辨原始荧光图像，依据外围损耗光引发的背景信号和激发光中心区域荧光信号存在的强度差异，使用灰度反转变换的方法，从原图像中构造出一幅与STED强度分布规律相适应的的背景荧光图像，进行差分运算处理，提高原始超分辨图像的质量。超分辨成像装置包括激发光模块、损耗光模块、扫描模块以及荧光信号探测模块。同时本发明在具体实施过程中提出将超分辨成像技术与像质评价技术相结合，调控损耗光功率，进一步降低因损耗不完全等原因引发的荧光背景噪声，在提升成像质量的同时节约成本、简化系统，具有较好的可行性。

技术领域

本发明属于光学显微技术领域，具体涉及一种STED超分辨图像背景噪声差分抑制方法，用来提高STED超分辨图像质量。

背景技术

在光学成像系统中，由于衍射极限的存在，光学显微镜能够达到的极限分辨率在200nm左右，通常无法满足对于纳米尺度结构的观测。为了能够突破光学衍射极限，同时在低损伤情况下观察生物样品甚至是活体样品，研究人员提出了一系列的远场光学超分辨显微成像方法。其中较为主流的有受激辐射损耗显微术(Stimulated Emission Depletion,STED)、光激活定位显微术(Photoactivated Localization Microscopy,PALM)、随机光学重建显微术(Stochastic Optical Reconstruction Microscopy,STORM)、结构光照明显微术(Structure Illumination Microscopy,SIM)。超分辨技术为生物医学领域提供了强有力的研究工具，相关研究人员于2014年获得了诺贝尔化学奖。

受激辐射损耗显微术因具有实时成像、分辨率高等优点而被广泛应用。其原理是利用两束激光进行照射，一束光作为激发光，另一束光作为损耗光。激发光使电子跃迁到激发态，通过自发辐射的方式发射出荧光，而被调制成涡旋空心型的损耗光使处于激发光斑外围的电子以受激发射的方式回到基态，抑制荧光发射，如图6所示。其中激发光光斑中心区域荧光发射不受损耗光的影响，将继续通过自发辐射发射出荧光，经过滤光处理后由探测器收集获得超分辨荧光图像。此方法有效地减小样品的荧光发光面积，压缩成像系统的点扩散函数，从而提高成像的分辨率。

然而，STED作为一种在生物领域广泛应用的工具，技术上依然存在许多限制的地方。目前STED的附加背景噪声是一个不可避免的问题，这对图像的分辨率与对比度都有一定的影响(如图4(a)所示：Gao Peng,et al.Background suppression in fluorescencenanoscopywith stimulated emission double depletion.Nature Photonics 11.3(2017):163)。背景噪声来源主要分为两种：一是由于损耗光强度较低使得外围区域荧光未被完全损耗，环形区域还有部分荧光残留；二是损耗光波长接近激发区，当损耗光光强过大时由于反斯托克斯激发效应产生背景荧光。

抑制STED超分辨图像背景噪声方法的基本思路是通过获取荧光背景图像进行差分优化，其中背景图像的获取手段是方法的关键。目前许多关于STED超分辨背景噪声抑制方法的研究工作，在获取荧光背景图像的手段上，大多是根据背景噪声的产生特性，使用物理手段进行探测与估计。其中受激发射双光束损耗(Stimulated Emission DoubleDepletion,STEDD)技术最具有代表性。STEDD的原理是用三束脉冲激光分时段照射样品，前两束高斯型激发光和环形损耗光用于常规的STED超分辨荧光成像，经过特定时延后加入第三束高斯型的损耗光，提取荧光背景噪声，再通过图像加权差分的方式去除掉背景噪声。STEDD虽然在抑制STED荧光噪声上起到一定的效果，但使用的光路复杂、需要三束光耦合以及严格的时序控制，存在调试困难、成本较高等问题。类似的通过物理手段探测估计背景图像的方法，在实际操作中也都面临相同的困境。

针对损耗光引发的未完全损耗和反斯托克斯激发效应，产生的荧光背景噪声问题，目前还需要开发一些有效、简单且低成本的方法来解决这个问题。