[发明专利]一种STED超分辨图像背景噪声差分抑制方法

权利要求书

1.一种STED超分辨图像背景噪声差分抑制方法，包括以下步骤：

1）第一激光器输出第一束连续激光作为激发光，通过第一滤光片及第一空间滤波系统滤波后，经高数值孔径的物镜聚焦到荧光材料，通过电子自发辐射跃迁发射荧光；

2）第二激光器输出第二束连续激光作为损耗光，通过第二滤光片及第二空间滤波系统滤波后，经过半波片及1/4波片组合模块调整偏振，再通过0～2π涡旋相位板调制形成涡旋空心型光束，使用分光棱镜将激发光和损耗光同轴耦合，实现荧光的受激辐射损耗；

3）荧光材料发射的信号，经过物镜收集，通过第三滤光片筛选出荧光信号，由光电倍增管进行探测，获得扫描点处的荧光强度信号，再通过XY方向扫描，获得完整的荧光超分辨图像；

4）通过调整损耗光光强，扫描多幅STED超分辨荧光图像并代入图像评价函数进行计算，经过比较确定一定范围内评价函数取最大值时的损耗光光强，在此损耗光光强下扫描，提升原始超分辨荧光图像质量；

5）对于在步骤4）中确定的损耗光光强下采集的超分辨图像，依据外围损耗光引发的背景信号和激发光中心区域荧光信号存在的强度差异，使用灰度反转变换的方法，从原图像中构造出一幅与STED强度分布规律相适应的背景荧光图像，通过原图像与构造的背景荧光图像差分运算，提高超分辨图像的质量；

6）调节参数，提升优化效果，对背景信号构造公式中的参数进行调节，在不同参数下构造不同的背景荧光图像并进行差分运算，选取最佳优化效果的STED超分辨图像；

步骤4）所述的图像评价函数表达式如下：

，其中FFT表示傅里叶变换符号，f_sted(x,y)表示原始STED超分辨荧光图像强度分布，W(ξ,η)表示频率权重函数，，ξ和η表示图像中各自方向频域空间的频率大小，ξ_max和η_max表示各自方向频率空间内最大频率值，根据奈奎斯特采样定律，采样频率是信号最大频率的两倍，，δ_ξ和δ_η表示图像中单个像素的空间尺寸，在采集二维图像传感器设计中，在两个维度的采样率是相同，而图像二维傅里叶频谱中各自方向的频率表示，因此W(ξ,η)的表达式能进一步化简为，r_ξ和r_η表示不同方向向量的大小，r_ξmax 和r_ηmax表示不同方向向量最大值；评价函数的值越大表示图像高频分量越多，激发中心区域荧光信号越强，荧光背景噪声受到抑制；

步骤5）所述的通过原图像与构造的背景荧光图像差分运算，包括以下几个步骤：

(1)依据外围损耗光引发的背景信号和激发光中心区域荧光信号存在的强度差异，使用灰度反转变换的方法，从原图像中构造出一幅与STED强度分布规律相适应的背景荧光图像：

其中a，b代表调节因子，f_bg(x,y)表示构造的荧光背景噪声强度图像，f_sted(x,y)表示原始STED超分辨荧光图像强度分布，max表示取最大灰度值，min表示取最小灰度值；

(2)构造荧光背景噪声强度之后，通过差分运算方式： f_sig(x,y)＝f_sted(x,y)-f_bg(x,y)，分离出激发中心区域有效荧光信号；

步骤6）所述的调节参数，提升优化效果，包括以下几个步骤：

(1)对背景荧光图像构造公式中的调节因子a、b进行调整，构造不同的背景信号图像，并获取对应差分优化图像，调节因子的作用在于构造合适的背景噪声强度，具体的取值范围由图像灰度的量化等级决定；

(2)引入图像评价函数，对前面获取的不同调节因子下的优化图像逐一计算函数值，因为激发中心有效荧光信号属于高频信号，而背景噪声属于低频信号，所以荧光图像评价函数通过计算图像高频信号的权重评估图像质量，函数公式如下：

其中FFT表示傅里叶变换符号，f_sig(x,y)表示差分获得的图像强度分布，W(ξ,η)表示频率权重函数，其含义与步骤4中的W(ξ,η)含义相同；

(3)经过以上计算获得图像评价函数Q与调节因子a、b之间的函数关系图，筛选出图像评价函数取最大值时的a、b值，从而获取最佳优化效果的STED超分辨图像。