[发明专利]大肠杆菌表达的重组鸡干扰素α产品及其制备方法与用途

说明书

本发明公开了一种大肠杆菌表达的重组鸡干扰素α产品及其制备方法与用途，属于生物技术领域。本发明将重组大肠杆菌工程菌经过发酵培养、向其中加入IPTG经过诱导4‑6小时后结束发酵，离心获得菌体，将所述菌体经过破碎裂解得到鸡干扰素α蛋白包涵体，将所述鸡干扰素α蛋白包涵体经过变性溶解，并利用镍‑琼脂糖凝胶FF层析柱进行层析纯化，之后经过蛋白复性，并与保护剂混合同时加入注射用水稀释，经过分装获得重组鸡干扰素α的成品，不仅实现了菌体的高密度发酵，同时显著提高了鸡干扰素α蛋白纯化的效果以及生物学活性。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种大肠杆菌表达的重组鸡干扰素α产品及其制备方法与用途。

背景技术

干扰素是一类在同种细胞上具有抗病毒活性的糖蛋白，通过抑制病毒DNA和RNA的复制达到预防和治疗效果。1957年自Isaacs和Lindenmann发现干扰素以来，干扰素已经显示出了极强的抗病毒、免疫调节活性和广阔的应用前景。因而，干扰素的研究越来越受到人们的广泛关注。与传统的保健治疗药物相比，干扰素在治疗效果及使用时机方面显示出了极大的优越性。

由于干扰素具有强大的抗病毒作用，目前有许多研究报道用于治疗家禽病毒性疾病。大量研究结果表明，重组鸡干扰素α在用于防治鸡禽流感、传染性法氏囊炎、传染性支气管炎等病毒性疾病时，具有显著的抗病毒效果。

基因工程干扰素是采用基因工程技术将动物体内天然干扰素基因亚克隆入原核表达载体，继而转入受体细胞，构建工程菌。通过工程菌发酵表达，分离纯化等步骤最终获得的高纯度干扰素产品。

本发明公开了一种大肠杆菌工程菌表达的重组鸡干扰素α产品制备及其应用效果，属于用分子生物学方法获得的基因工程生物制品。将新型设计的鸡α干扰素基因序列重组到pET21a(+)载体，然后通过转化方式转入受体大肠杆菌。并采用大肠杆菌表达系统表达外源基因，有利于鸡α干扰素基因商业化生产。所制备的产品可用于制备病害防治药物、免疫增强剂，也可用于禽类免疫机制的理论研究。

发明内容

本发明所要解决的问题在于提供一种大肠杆菌工程菌表达的重组鸡干扰素α产品及其制备方法与用途。

所述大肠杆菌工程菌是以BL21(DE3)作为宿主，构建的工程菌株为：E.coli BL21(DE3)/pET21a(+)-ChIFNα。所述工程菌株及其构建方法来源于申请号为201410755900.7的发明专利《重组鸡干扰素α及其制备方法》。

所述工程菌株表达的重组鸡干扰素α的cDNA序列为优化后的基因序列如SEQ IDNO：1所示。

为了解决上述问题，本发明提供一种大肠杆菌工程菌表达的重组鸡干扰素α产品的制备方法，步骤如下：

将大肠杆菌工程菌经过发酵培养、向其中加入IPTG经过诱导4-6小时后结束发酵，离心获得菌体，将所述菌体经过破碎裂解得到重组鸡干扰素α蛋白包涵体，将所述重组鸡干扰素α蛋白包涵体经过变性溶解，并利用镍-琼脂糖凝胶FF层析柱进行层析纯化，之后经过蛋白复性，并与保护剂混合同时加入注射用水稀释，经过分装获得重组鸡干扰素α的成品；

所述蛋白复性中所用复性液组成为：0.5M精氨酸，2mM EDTA，0.8mM GSSG(氧化型谷胱甘肽)，50mM Tris，20％甘油，余量为水，pH7.0。(％为质量百分比)

优选地，所述层析纯化中所用洗脱缓冲液组成为：6M GU-HCl，20mM tris-HCl，500mM咪唑，余量为水，pH 7.5。

优选地，所述工程菌发酵培养步骤为：将所述工程菌经活化后按照接种量5％-10％接种于发酵培养基中，36.8-37.2℃条件下发酵，控制pH值6.8-7.2，通过搅拌速度及通气量控制溶氧≥30％。

优选地，所述大肠杆菌工程菌表达的重组鸡干扰素α产品的制备方法，步骤如下：