[发明专利]大肠杆菌表达的重组鸡干扰素α产品及其制备方法与用途

权利要求书

1.一种大肠杆菌表达的重组鸡干扰素α产品的制备方法，其特征在于：步骤如下：

将大肠杆菌工程菌经过发酵培养、向其中加入IPTG经过诱导4-6小时后结束发酵，离心获得菌体，将所述菌体经过破碎裂解得到重组鸡干扰素α蛋白包涵体，将所述重组鸡干扰素α蛋白包涵体经过变性溶解，并利用镍-琼脂糖凝胶FF层析柱进行层析纯化，之后经过蛋白复性，并与保护剂混合同时加入注射用水稀释，经分装获得重组鸡干扰素α产品；

所述蛋白复性中所用复性液组成为：精氨酸0.5M，2mM EDTA，0.8mM GSSG，50mM Tris，20％甘油，余量为水，pH7.0；

所述层析纯化中所用洗脱缓冲液组成为：6M GU-HCl，20mM tris-HCl，500mm咪唑，余量为水，pH 7.5。

2.如权利要求1所述的一种大肠杆菌表达的重组鸡干扰素α产品的制备方法，其特征在于：所述大肠杆菌工程菌发酵培养步骤为：将所述大肠杆菌工程菌经活化后按照接种量5％-10％接种于发酵培养基中，36.8-37.2℃条件下发酵，控制pH值6.8-7.2，通过搅拌速度及通气量控制溶氧≥30％。

3.如权利要求1所述的一种大肠杆菌表达的重组鸡干扰素α产品的制备方法，其特征在于：步骤如下：

(1)将所述工程菌经活化后按照接种量5％-10％接种于发酵培养基中，于36.8-37.2℃，pH 6.8-7.2下发酵，控制溶氧≥30％；

(2)待发酵培养至菌体浓度OD_600nm＝40时，加入IPTG至终浓度为0.5-lmmol/L，诱导4-6小时后结束发酵，经离心收集湿菌体；

(3)向所述步骤(2)得到的湿菌体中按照质量体积比1：(9-11)加入裂解缓冲液，经混合、超声、离心后，收集沉淀，得到重组鸡干扰素α蛋白包涵体；

(4)将所述重组鸡干扰素α蛋白包涵体用10-20倍体积的变性溶解液，经混合溶解后经离心，收集变性液，弃沉淀，得到粗制重组鸡干扰素α变性液；所述变性溶解液组成为：6M的盐酸胍，1.5mM EDTA，30mM Tris，8mM DTT，余量为水；

(5)利用结合缓冲液将镍-琼脂糖凝胶FF层析柱平衡后，将所述粗制重组鸡干扰素α变性液进行上样，流速为50-100cm/h，上样完毕后分别经所述结合缓冲液去除杂蛋白、洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，得到纯化后的重组鸡干扰素α变性液；所述结合缓冲液组成为：6M GU-HCl，20mMtris-HCl，0.5M NaCl，20mm咪唑，余量为水，pH 7.5；

(6)将所述纯化后的重组鸡干扰素α变性液按照与复性液体积比1:(14-16)，滴入复性液中，连续搅拌复性至少48h，即为重组鸡干扰素α复性原液；

(7)所述重组鸡干扰素α复性原液经与保护剂混合同时加入注射用水稀释后经分装获得重组鸡干扰素α产品。

4.如权利要求3所述的一种大肠杆菌表达的重组鸡干扰素α产品的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中，待培养2.5-3.5h后，开始补充料液，补料速度800mL-1600mL/h，补料体积5L；所述料液的组成为：所述料液的组成为(g/L)：葡萄糖：200，蛋白胨：10，酵母粉：10，余量为水。

5.如权利要求3所述的一种大肠杆菌表达的重组鸡干扰素α产品的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中，超声条件为：以2400w功率进行间歇超声破碎菌体，超声5s，停20s，超声总时间：35min。

6.如权利要求3所述的一种大肠杆菌表达的重组鸡干扰素α产品的制备方法，其特征在于：所述步骤(7)中，蛋白保护剂组成为：葡萄糖60-80g/L；吐温80 3-5g/L，余量为注射用水配制，118℃灭菌15min。

7.如权利要求6所述的一种大肠杆菌表达的重组鸡干扰素α产品的制备方法，其特征在于：所述步骤(7)中，重组鸡干扰素α复性原液与保护剂按照体积比20：1混合，并加入注射用水稀释至重组鸡干扰素α终浓度为原浓度的五分之一，充分搅匀，用孔径为0.22μm除菌滤膜过滤后即为半成品。