[发明专利]一种流感病毒基因组末端检测方法及其应用

说明书

本发明公开了一种流感病毒基因组末端检测方法，包括如下步骤：1)提取流感病毒基因组，经反转录、环化反应得到环化的cDNA；2)对步骤1)所得环化cDNA进行巢式反向PCR扩增，得到含有各个病毒基因片段3’和5’末端序列的PCR产物；3)将步骤2)所得PCR产物克隆进入载体后，挑取至少2个克隆进行测序并分析测序结果，通过流感病毒基因组各基因片段高度保守的3’末端非编码区序列和5’末端非编码区序列的定位，即可获得准确的5’和3’末端非编码区及其临近编码区内的核苷酸序列。采用本发明的检测方法，可简便、快速的完成流感病毒基因组各个片段的3’和5’末端序列扩增和检测，从而显著地提高B型流感病毒的拯救效率，推动B型流感疫苗的开发。

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，尤其是一种流感病毒基因组末端检测方法及其在B型流感病毒反向遗传操作系统构建中的应用。

背景技术

B型流感病毒(Influenza B virus)属于正黏病毒科，B型流感病毒属，是单股、负链、分节段的RNA病毒。B型流感病毒常在流感流行季节中引起局部的暴发和流行，儿童、老年人和慢性病患者更为易感。流行病学调查显示，儿童感染流感病毒的死亡病例中有20％～44％的患者为B型流感病毒感染。在20世纪早期阶段，B型流感病毒只有一个分型。随着病毒的不断进化，在1980年以后，B型流感病毒形成2个分支—Victoria亚系和Yamagata亚系。不同亚系的B型流感病毒具有不同的抗原性，二者之间的交叉保护性较差，每年的流感流行季会以一个亚型的流感病毒为主导。2001年开始，2个亚系的B型流感病毒通常会同时出现在流感流行季节。由此，当前B型流感疫苗的设计和诊断方法的建立需要同时针对2个亚系的流感病毒均有效。

反向遗传操作是一项人工拯救流感病毒的技术，将流感病毒基因组的8个基因片段分别构建入RNA聚合酶I(Pol I)和RNA聚合酶I(Pol II)启动子/终止子双向表达载体中，8质粒转染细胞后，通过在体外细胞中模拟病毒基因组在宿主细胞中的转录、翻译和病毒包装过程，最终获得流感病毒。利用反向遗传操作技术，对流感病毒基因片段进行基因重组和基因改造，进而制备高产和高效的流感疫苗，是当前流感疫苗研究的重要方向。

流感病毒基因组内各个基片段的5’和3’末端非编码区(UTR)和邻近UTR的编码区部分序列(～150bp)共同组成了流感病毒基因组的包装信号。包装信号区域核酸序列对流感病毒拯救效率、重组病毒的生长、复制和致病力等方面都具有重要的影响。包装信号序列的突变、缺失等偏差，会直接影响基因片段包装入基因组的效率，影响病毒的生长和复制，甚至会导致病毒拯救的失败。在已有数据库(Genebank,GISAID等)中公布的B型流感病毒基因组各片段序列大多只包含完整的基因编码框(ORF)内的序列，非编码区序列缺失或者部分缺失。而非编码区序列属于基因片段的包装信号区，其序列的完整性和准确性决定了基因片段的包装效率，是流感病毒拯救成功与否的关键因素。因此，快速、准确的测定B型流感病毒基因片段5’和3’末端序列对于B型流感病毒反向遗传操作系统的建立以及后续新型流感疫苗设计与拯救、流病毒生长复制、致病性等研究工作都具有重要意义。

cDNA末端快速扩增技术(RACE)是准确测定cDNA末端以及全长的一种有效方法。传统的RACE技术原理为通过一段锚定序列和一个基因特异性引物进行PCR，具有非特异扩增严重的缺陷。并且，RACE技术需要分别对基因片段的5’和3’末端进行PCR扩增、克隆和测序，操作繁琐，费时费力。因此，有必要建立一种简便、准确、可同时测定B型流感病毒基因组片段3’和5’双末端序列扩增方法。

发明内容

基于上述问题，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种可简便地同时测定B型流感病毒基因组片段3’和5’双末端序列扩增方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案包括以下几个方面：

在第一个方面，本发明提供了一种流感病毒基因组末端检测方法，包括如下步骤：