[发明专利]一种重组(R)-ω-转氨酶及其突变体和应用

说明书

本发明公开了一种新型重组(R)‑ω‑转氨酶及其突变体和应用，该新型重组(R)‑ω‑转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，突变体由SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第72位和第248位经单点或二点突变得到。本发明先通过基因重组技术获得高酶活的新型重组(R)‑ω‑转氨酶，再进一步通过定点突变获得新型重组(R)‑ω‑转氨酶突变体，该突变体不仅具有高酶活(1245.2U/g)、高立体选择特性(e.e.值99.9％)，而且能够高效催化前体酮类似物制备西他列汀中间体，转化率最高可达97.4％。

技术领域

本发明涉及生物化学技术领域，尤其涉及一种重组(R)-ω-转氨酶及其突变体和应用。

背景技术

西他列汀，英文名称sitagliptin，全称(3R)-3-氨基-1-[3-(三氟甲基)-5,6,7,8-四氢-1,2,4-三唑并[4,3-a]吡嗪-7-基]-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮，是由Merck和Codexis公司研制和开发的一种二肽基肽酶-4(DPP-4)抑制药，可通过保护内源性肠降血糖素和增强其作用而控制血糖水平，是一种有巨大潜力Ⅱ型糖尿病的治疗药物。

制备sitagliptin主要是不对称合成法，通常使用转氨酶为生物催化剂进行生物转化。转氨酶(transaminase，简称TA，EC 2.6.1.X)是辅酶型5’-磷酸吡哆醛(PLP)依赖型酶。在反应过程中PLP与5’-磷酸吡哆胺(PMP)会相互进行转换，同时催化氨基从合适的供体到羰基受体的可逆转移。TA可以被分为α-TA和ω-TA。其中，ω-TA可以催化任何结构的酮和胺，具有更高的应用价值。

催化制备sitagliptin的酶属于(R)-ω-TA。Codexis公司以Arthrobacter sp.来源的(R)-ω-ATA-117为研究对象，首先利用定点饱和突变对底物结合区域大口袋进行改造，获得突变体对1-[3-(三氟甲基)-5,6,7,8-四氢-1,2,4-三唑并[4,3-a]吡嗪-7-基]-1,3-丁二酮(简称：截短前体酮)展现了催化活性。然后对该突变体进行11轮分子改造，最终获得了催化1-[3-(三氟甲基)-5,6,7,8-四氢-1,2,4-三唑并[4,3-a]吡嗪-7-基]-4-(2,4,5-三氟苯基)-1,3-丁二酮(简称：前体酮底物)的高产突变体，催化活性较野生菌酶活提高了28000倍。(Savile C K,Janey J M,Mundorff E C,et al.Biocatalytic AsymmetricSynthesis of Chiral Amines from Ketones Applied to Sitagliptin Manufacture[J].Science，2010，329(5989):305-309.)。

DNA重组技术是将不同的遗传物质在体外进行剪切、拼接和组合，使遗传物质重新组合，然后通过载体转入微生物、植物和动物细胞内，进行无性繁殖，并使所需的基因在细胞内表达，产生人类所需的产物或是新生物的类型。利用分子生物学技术，可建立高效的新型转氨酶基因工程菌株，实现高活性、高稳定性、并且能满足工业化生产的转氨酶菌株。通过使用该方法能改进传统定点突变技术的不确定性，迅速获得高产工业菌株。重组DNA技术已经在细胞分化、生长发育、肿瘤发生等基础研究和工农业生产、医药保健等实际应用两方面取得了重要的突破。

发明内容

本发明提供了一种重组(R)-ω-转氨酶、重组(R)-ω-转氨酶突变体及其应用，尤其涉及生物催化前体酮类似物1-(吡咯烷-1-基)-4-(2,4,5-三氟苯基)-1,3-丁二酮合成西他列汀中间体(R)-3-氨基-1-(吡咯烷-1-基)-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮中的应用，该新型重组(R)-ω-转氨酶和新型重组(R)-ω-转氨酶突变体不仅具有较高的酶活，而且能够高效催化前体酮类似物制备西他列汀中间体，尤其是新型重组(R)-ω-转氨酶突变体的转化率最高可达97.4％。

具体技术方案如下：

本发明提供了新型重组(R)-ω-转氨酶，该新型重组(R)-ω-转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。