[发明专利]一种落叶松体细胞胚再生的方法

说明书

本发明提供了一种落叶松体细胞胚再生方法，所述方法的步骤包括：采集落叶松未成熟种子合子胚为外植体，诱导出落叶松胚性愈伤组织；在新继代培养基上培养7～10天，选择生长良好的胚性愈伤组织，接于锥形瓶中液体培养基中，于摇床50～125rpm，20～25℃，悬浮条件下暗培养4～7天；然后将培养物转入半固体培养基，于摇床50～125rpm，20～25℃，悬浮条件下暗培养4～7天；最后将培养物接于固体培养基表面，20～25℃，暗培养23～30天，形成后期子叶胚。所述方法能大量诱导产生优质体细胞胚，减少畸形胚，诱导体胚形成时间短，且能达到更好的同步化效果并且具有高诱导效率。

技术领域

本发明涉及落叶松植物栽培领域，具体涉及一种落叶松体细胞胚再生的方法。

背景技术

落叶松(LarixLeptolepis)是我国北方及亚热带中高山地区的针叶速生造林用材树种，具有分布广泛、适应性强、病虫害少、材质优良等特点，且早期速生性在所有的针叶树中位居前列，是国营林场和农民都非常重视的造林树种，人工造林面积目益扩大。因此，开展落叶松育种研究工作是我国针叶树改良的一个重要领域。落叶松常规繁殖方法是种子繁殖或无性(扦插)繁殖，但由于落叶松种子繁殖周期长、发芽率低，无性扦插繁殖系数较低，并且存在年龄效应、位置效应及取材困难等问题，难以满足大面积种植的要求。相较于传统繁育手段，体细胞胚发生具有繁殖效率高、不受季节限制的优点，可以克服实际生产中落叶松种子产量不稳定、子代变异大、扦插繁殖生根率较低等问题。

对于落叶松的体细胞胚胎发生的研究从20世纪80年代即已开始。日本落叶松、长白落叶松、日本×长白落叶松及日本×欧洲落叶松(L.kaempferi×decidua)等落叶松属种及杂种均已相继建立了相应的体胚胎发生体系(Klimaszewska，1989；Thompson et al.，1992；Yong et al.，1998；齐力旺，2000；吕守芳等，2005；王伟达，2008；Lelu et al.，2011)。但受到组织增殖效率及体胚成熟率低等因素的影响，目前的技术体系仍不能满足落叶松体胚商业化生产的要求。

针对目前落叶松体细胞胚胎发生过程中，体细胞胚诱导一般是在特定成分的单一固体培养基上诱导胚性愈伤形成体细胞胚，存在体细胞胚发生率低，体胚形成时间长，畸形率高，发生不同步，萌发率低等缺点的问题，本申请提出新的体细胞胚再生方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种落叶松体细胞胚再生方法，解决体细胞胚发生率低，体胚形成时间长，畸形率高，发生不同步，萌发率低的问题。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

一种落叶松体细胞胚再生方法，所述方法包括：

(1)采集落叶松未成熟种子合子胚作为外植体，清洗消毒后剥去种皮，取出幼胚，接种于胚性愈伤诱导培养基上20～25℃，暗培养，诱导落叶松胚性愈伤组织；

(2)选取步骤(1)中所述落叶松胚性愈伤组织转于胚性愈伤继代培养基上20～25℃，暗培养14～18天为一周期继代培养；

(3)新继代培养基上培养7～10天，选择生长良好的胚性愈伤组织约1g，使用镊子撕碎接于锥形瓶中50mL液体培养基中，于摇床50～125rpm，20～25℃，悬浮条件下暗培养4～7天；

(4)用细滤网滤出步骤(3)中培养基中培养物，转入锥形瓶中等体积的半固体培养基，于摇床50～125rpm，20～25℃，悬浮条件下暗培养4～7天；

(5)采用细滤网滤出步骤(4)培养基中培养物，用滤纸吸干水分，接于固体培养基表面，20～25℃，暗培养23～30天；获得落叶松幼苗；

所述步骤(1)-(5)需要在无菌条件下操作；