[发明专利]一种落叶松体细胞胚再生的方法

权利要求书

1.一种落叶松体细胞胚再生方法，所述方法包括：

(1)采集落叶松未成熟种子合子胚作为外植体，清洗消毒后剥去种皮，取出幼胚，接种于胚性愈伤诱导培养基上20～25℃，暗培养，诱导落叶松胚性愈伤组织；

(2)选取步骤(1)中所述落叶松胚性愈伤组织转于胚性愈伤继代培养基上20～25℃，暗培养14～18天为一周期继代培养；

(3)新继代培养基上培养7～10天，选择生长良好的胚性愈伤组织约1g，使用镊子撕碎接于锥形瓶中50mL液体培养基中，于摇床50～125rpm，20～25℃，悬浮条件下暗培养4～7天；

(4)用细滤网滤出步骤(3)中培养基中培养物，转入锥形瓶中等体积的半固体培养基，于摇床50～125rpm，20～25℃，悬浮条件下暗培养4～7天；

(5)采用细滤网滤出步骤(4)培养基中培养物，用滤纸吸干水分，接于固体培养基表面，20～25℃，暗培养23～30天；获得落叶松幼苗；

所述步骤(1)-(5)需要在无菌条件下操作；

所述胚性愈伤诱导培养基的成分和含量(mg/L)为：2,4-D(1.0)，6-BA(0.5)，KT(0.3)，谷氨酰胺(500)，水解酪蛋白(500)，甘氨酸(2)，蔗糖(20000)，肌醇(1000)，维生素B₁(0.5)，维生素B₆(0.5)，KNO₃(2337)，NH₄NO₃(275)，KH₂PO₄(85)，CaCl₂·2H₂O(327)，MgSO₄·7H₂O(172)，H₃BO₃(3.1)，ZnSO₄·7H₂O(4.3)，MnSO₄·H₂O(8.45)，Na₂MoO₄·2H₂O(0.125)，KI(0.415)，CuSO₄·5H₂O(0.0125)，CoCl₂(0.0125)FeSO₄·7H₂O(13.9),Na₂·EDTA·H₂O(18.6),琼脂3g/L；

所述胚性愈伤继代培养基的成分和含量(mg/L)为：2,4-D(0.15)(或NAA(0.3))，6-BA(0.05)，KT(0.05)，谷氨酰胺(500)，水解酪蛋白(500)，甘氨酸(2)，蔗糖(30000)，肌醇(1000)，维生素B₁(0.5)，维生素B₆(0.5)，KNO₃(2337)，NH₄NO₃(275)，KH₂PO₄(85)，CaCl₂·2H₂O(327)，MgSO₄·7H₂O(172)，H₃BO₃(3.1)，ZnSO₄·7H₂O(4.3)，MnSO₄·H₂O(8.45)，Na₂MoO₄·2H₂O(0.125)，KI(0.415)，CuSO₄·5H₂O(0.0125)，CoCl₂(0.0125)FeSO₄·7H₂O(13.9),Na₂·EDTA·H₂O(18.6),琼脂5g/L；

所述液体培养基的成分和含量(mg/L)为：聚乙二醇(PEG)4000(100000)，脱落酸(ABA)(15)，AgNO₃(10)，谷氨酰胺(500)，水解酪蛋白(500)，甘氨酸(2)，蔗糖(45000)，肌醇(1000)，维生素B₁(0.5)，维生素B₆(0.5)，KNO₃(2337)，NH₄NO₃(275)，KH₂PO₄(85)，CaCl₂·2H₂O(327)，MgSO₄·7H₂O(172)，H₃BO₃(3.1)，ZnSO₄·7H₂O(4.3)，MnSO₄·H₂O(8.45)，Na₂MoO₄·2H₂O(0.125)，KI(0.415)，CuSO₄·5H₂O(0.0125)，CoCl₂(0.0125)FeSO₄·7H₂O(13.9)Na₂·EDTA·H₂O(18.6)；所述半固体培养基为所述液体培养基添加琼脂2g/L或结冷胶1g/L的半固体培养基；所述固体培养基为所述液体培养基添加琼脂10g/L或结冷胶7g/L的固体培养基。