[发明专利]一种单链快速建库方法及建库仪器

说明书

本发明提供一种单链快速建库方法，所述方法包括：提供DNA样本经多聚核苷酸激酶处理得到DNA混合物；在一个反应试管中将所述DNA混合物的3’端连接第一接头，将所述DNA混合物的5’连接第二接头；使用外切酶对所述第一接头和第二接头进行反应处理，以得到处理后的第一产物；对所述第一产物按照PCR进行扩增，以得到第二产物；所述第二产物经过使用磁珠进行纯化处理后去除所述磁珠，以得到文库。此外，本发明还提供一种应用上述方法的建库仪器。本发明提供的单链快速建库方法，通过在同一个反应试管中完成建库反应和扩增反应，节约反应时间，通过一次连接反应完成两端接头连接，减少单链建库的操作步骤，降低操作难度，缩短建库时间并进一步提高建库效率。

【技术领域】

本发明涉及基因测序文库技术领域,具体涉及一种单链快速建库方法及建库仪器。

【背景技术】

在目前市场上推出的主要单链建库方法有Swift公司的Accel-NGS Methyl-seq，Qiagen的QIAseq Methyl Library Kit。

Accel-NGS Methyl-seq主要存在的技术问题有两点。第一是3’端连接时引入的接头会有6-8bp的随机引物，导致生信分析时需要特殊处理，平均切除10bp的碱基，导致数据量下降。并且在测序时需要加入大量的 phix以加大文库多样性从而避免测序仪爆屏的问题。第二是测序的对象不是DNA模板链本身，而是模板链的互补产物链，引入了更多不确定性。同时。该项技术被国外垄断，单个样本建库价格极高，难以大规模推广应用。

Qiagen的QIAseq Methyl Library Kit单链建库技术同样存在着检测的DNA序列为模板链的互补产物，并且由于采用随机引物扩增，也会导致分析时需要剪切掉部分序列，造成数据浪费。该技术具有一定的偏向性，且技术本身不稳定，市场反应较差。

Splinted adaptor tagging(SPLAT)技术主要存在的问题有：1.耗时长，由于采用低浓度的连接酶以及需要纯化两次连接产物导致反应时间较长。SPALT技术采用的连接酶单位浓度低(5U/μl)，酶的最大反应量为 30U，导致每次连接时间长达1小时，由于要分别进行3’端及5’端接头连接，连接时间长达2小时。同时在反应过程中需要进行多步纯化，也需要耗费一段时间，并且纯化磁珠丢弃也造成了部分DNA损失。2. 所需DNA模板量较多，模板需要100ng，对于低起始量的DNA进行建库存在一定困难。

现有的单链建库技术中对SPLAT技术加以改进提高，可以进一步缩短时间并降低建库损失，但仍然存在操作复杂，DNA两端接头需要分批次加入导致原料浪费，建库效率低下的问题。

【发明内容】

本发明的目的在于减少单链建库的操作步骤，降低操作难度，缩短建库时间并进一步提高建库效率。

为实现上述目的，本发明提供一种单链快速建库的方法，所述方法包括：

步骤S10：提供DNA样本经多聚核苷酸激酶处理得到DNA混合物；

步骤S20：在一个反应试管中将所述DNA混合物的3’端连接第一接头，将所述DNA混合物的5’连接第二接头；

步骤S30：使用外切酶对所述第一接头和第二接头进行反应处理，以得到处理后的第一产物；

步骤S40：对所述第一产物按照PCR进行扩增，以得到第二产物；

步骤S50：所述第二产物经过使用磁珠进行纯化处理后去除所述磁珠，以得到文库。

进一步地，所述DNA样本包括cfDNA和打断至指定碱基对长度的 gDNA。

进一步地，所述步骤S20包括：

步骤S210：通过退火配对形成第一接头和第二接头；