[发明专利]用于快速检测犬瘟热病毒的引物组、荧光可视化RT-LAMP试剂盒及方法

说明书

本发明公开了用于快速检测犬瘟热病毒的引物组、荧光可视化RT‑LAMP试剂盒及方法。本发明的试剂盒中包含了针对犬瘟热病毒设计的引物组合，所述引物组合中包含了一对外引物、一对内引物和两条环引物。利用本发明制备的RT‑LAMP试剂盒可实现对犬瘟热病毒的高灵敏度和高特异性检测，检测灵敏度为10copies，同时检测方法操作简便，成本较低，设备适用范围广，可用于现场快速检测核酸，及时筛查，检测结果可肉眼直接观察，不需进行电泳，荧光检测LAMP即可获知检测结果。

技术领域

本发明涉及微生物检测技术领域，具体涉及一种用于快速检测犬瘟热病毒的引物组、荧光可视化RT-LAMP试剂盒及方法。

背景技术

犬瘟热(canine distemper，CD)是由犬瘟热病毒(canine distemper virus，CDV)引起犬的一种高度接触性传染病，传染性强，死亡率可高达80％以上，病犬以典型的双相热、上呼吸道、肺及胃肠道卡他性炎症，非化脓性脑膜-脊髓炎为特征。CDV属于副黏病毒科麻疹病毒属，基因组为不分节段的负链RNA，主要编码囊膜相关的蛋白(M)，两个糖蛋白(血凝素H和融合蛋白F)，两个转录酶相关的蛋白质(磷蛋白质P和大蛋白L)和核衣壳蛋白(N)。N基因序列保守性高，是CDV的主要抗原基因。

传统的犬瘟热检测方法主要包括胶体金免疫学诊断方法和分子生物学诊断方法。目前常用免疫学诊断方法是胶体金试纸检测方法。胶体金试纸在敏感性和特异性方面欠佳，还存在易受环境影响，一直未形成相应的诊断技术标准。常用分子生物学诊断方法有常规PCR和荧光定量PCR等。RT-PCR和Real-time RT-PCR虽然较之以往方法具有特异性更强、灵敏度高、重复性好，且自动化程度高等特点，但是对于操作人员的分子生物学技术背景要求很高，试剂成本很贵，特定仪器要求高，难以在基层实际生产中普及应用。临床动物医院或养殖户急需高效快速诊断的技术来满足临床快速诊断。

环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)，能在等温(60～65℃)条件下，短时间(通常是一小时内)内进行大量的核酸扩增，是一种“简便、快速、精确、低价”的基因扩增方法。与常规PCR相比，该方法不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程，具有简单、快速、特异性强的特点；在灵敏度、特异性和检测范围等指标上也能媲美甚至优于PCR技术，且该方法不依赖任何专门的仪器设备即可实现现场高通量快速检测，检测成本远低于荧光定量PCR。

LAMP的特征是针对靶基因上的六个区域设计四条引物，利用链置换型DNA聚合酶在恒温条件下进行扩增反应，可在15～60分钟内实现10⁹～10¹⁰倍的扩增，反应能产生大量的扩增产物即焦磷酸镁白色沉淀，可以通过肉眼观察白色沉淀的有无来判断靶基因是否存在。LAMP方法的优势除了高特异性和高灵敏度外，操作还十分的简单，在应用阶段对仪器的要求低，一个简单的恒温装置就能实现反应，结果检测也非常简单，直接肉眼观察白色沉淀或者绿色荧光即可，不像普通PCR方法需要进行凝胶电泳观察结果，是一种适合现场、基层快速检测的方法。荧光可视化快速检测犬瘟热病毒的RT-LAMP试剂盒是在LAMP技术的基础上添加了荧光，无需后续的电泳检测，直接在仪器上检测荧光或者肉眼判定，提高了检测的灵敏度。

虽然目前有一些研究者针对犬瘟热病毒开发了基于LAMP的检测方法，但上述方法中依然存在着检测灵敏度相对较低、易产生假阳性，严重制约着在它们在实际检测中的应用。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的是提供一组用于快速检测犬瘟热病毒的引物组，并制备具有高灵敏度、高特异性、高准确度、荧光可视化的RT-LAMP试剂盒，用于犬瘟热病毒的快速、精确地检测。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

第一方面，本发明提供一组用于快速检测犬瘟热病毒的引物组，其包括一对特异性外引物，一对特异性内引物和一条环引物，其核苷酸序列分别为：