[发明专利]用于快速检测犬瘟热病毒的引物组、荧光可视化RT-LAMP试剂盒及方法

权利要求书

1.一组用于快速检测犬瘟热病毒的引物组，其特征在于，其包括：

外引物F3：核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

外引物B3：核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

内引物FIP：核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

内引物BIP：核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

环引物LF：核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

环引物LB：核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

2.权利要求1所述的引物组在制备检测犬瘟热病毒的RT-LAMP试剂盒中的应用。

3.一种用于快速检测犬瘟热病毒的荧光可视化RT-LAMP试剂盒，，其特征在于，其包括如权利要求1中所述的外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP、环引物LF、环引物LB、荧光目视检测剂、含有Bst DNA聚合酶和逆转录酶的酶反应液。

4.根据权利要求3所述的荧光可视化RT-LAMP试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括2×反应缓冲液。

5.根据权利要求3所述的荧光可视化RT-LAMP试剂盒，其特征在于，所述试剂盒10×Thermopol buffer、50mmol/L MgSO₄溶液、5.0mmol/L甜菜碱溶液和10mmol/L dNTPs。

6.根据权利要求3-5中任一项所述的荧光可视化RT-LAMP试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性质控标准品和阴性质控标准品，所述阳性质控标准品为含有犬瘟热病毒N基因的重组质粒，所述犬瘟热病毒N基因的序列如SEQ ID NO.7所示，阴性质控标准品为无RNA酶蒸馏水。

7.一种用于检测犬瘟热病毒的方法，其特征在于，其包括如下步骤：

S1、从样品中提取RNA；

S2、对步骤S1提取的所述RNA进行等温扩增；其中，在反应体系中，采用如权利要求要求1所述的引物组，置于63℃恒温反应；

S3、结果判定：60分钟内呈现绿色为阳性，60分钟内呈现橘黄色为阴性。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，在步骤S2中，所述反应体系包括：

18μL的RT-LAMP预混液：2×反应缓冲液12.5μL、5μmol/L的外引物F3 1μL、5μmol/L的外引物B3 1μL、40μmol/L的内引物FIP 1μL、40μmol/L的内引物BIP 1μL、20μmol/L的环引物LF0.75μL、20μmol/L的环引物LB 0.75μL；

酶溶液1μL；

荧光目视检测试剂1μL；

和样品RNA 5μL。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，在步骤S2中，所述反应体系包括：

17μL的RT-LAMP预混液：10×Thermopol buffer 2.5μL、50mmol/L MgSO₄ 3.5μL溶液、5.0mmol/L甜菜碱溶液2.5μL、10mmol/L dNTPs 3μL、5μmol/L的外引物F3 1μL、5μmol/L的外引物B3 1μL、40μmol/L的内引物FIP 1μL、40μmol/L的内引物BIP 1μL、20μmol/L的环引物LF0.75μL、20μmol/L的环引物LB 0.75μL；

8.0U/μL的Bst DNA聚合酶0.8μL和10U/μL AMV逆转录酶0.2μL；

10mmol/L MnCl₂溶液1.5μL、1.0mmol/L的钙黄绿素溶液0.5μL；

和样品RNA 5μL。

10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，在步骤S2中，设置阳性质控和阴性质控进行检测，其中，所述阳性质控为含有犬瘟热病毒N基因的质粒，所述犬瘟热病毒N基因的序列如SEQ ID NO.7所示，所述阴性质控为无RNA酶蒸馏水。