[发明专利]液相色谱-质谱/质谱法测定植物源食品中灭草松残留量的方法

权利要求书

1.液相色谱-质谱/质谱法测定植物源食品中灭草松残留量的方法，其特征在于液相色谱-质谱/质谱法测定植物源食品中灭草松残留量的方法按照以下步骤进行：

一、取苹果、番茄、菜豆、萝卜、甘蓝、香菇或洋葱样品500g，将样品可食部分切碎后，用捣碎机将样品加工成浆状，混匀，于-18℃以下冷冻保存，得到均匀试样；

二、提取：

称取5g均匀试样，置于50mL离心管中，加入0.3mL浓度为1mol/L的盐酸溶液、20mL乙腈，用均质器以15 000r/min均质2min，在5 000r/min下离心5min后，将上清液转移至50mL容量瓶中，残留物再用20mL乙腈重复提取一次，合并提取液于同一容量瓶中，并用水定容至50mL，移取10mL提取液，用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至6.0～8.0，并在10000r/min离心5min，待净化；

三、净化：

在流速为1mL/min～2mL/min的条件下将步骤二所得样液全部转移到已依次用3mL甲醇、3mL水活化后的强阴离子交换固相萃取柱中，弃去流出液，依次用3mL水、3mL甲醇淋洗净化柱，最后用3mL体积浓度为2％的甲酸甲醇溶液洗脱，在流速为1mL/min～2mL/min的条件下，收集洗脱液于15mL刻度离心管中，洗脱液在45℃下，经氮吹仪吹干后，用1.0mL乙腈0.1％甲酸溶液振荡溶解残渣，过0.22μm滤膜，得到净化液，供液相色谱-质谱测定；

四、定性测定：

称取灭草松用乙腈配制成1.0mg/mL的标准储备液，取标准储备液2mL至100mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配制成浓度为2μg/mL标准中间工作液；

将没有灭草松农药检出的苹果、番茄、菜豆、萝卜、甘蓝、香菇或洋葱样品500g，将样品可食部分切碎后用捣碎机将样品加工成浆状，混匀，得均匀试样；

提取：称取5g均匀试样，置于50mL离心管中，加入0.3mL浓度为1mol/L的盐酸溶液、20mL乙腈，用均质器以15 000r/min均质2min，在5 000r/min下离心5min后，将上清液转移至50mL容量瓶中，残留物再用20mL乙腈重复提取一次，合并提取液于同一容量瓶中，并用水定容至50mL，移取10mL提取液，用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至6.0～8.0，并在10000r/min离心5min，待净化；

净化：在流速为1mL/min～2mL/min的条件下将步骤二所得样液全部转移到已依次用3mL甲醇、3mL水活化后的强阴离子交换固相萃取柱中，弃去流出液，依次用3mL水、3mL甲醇淋洗净化柱，最后用3mL体积浓度为2％的甲酸甲醇溶液洗脱，在流速为1mL/min～2mL/min的条件下，收集洗脱液于15mL刻度离心管中，洗脱液在45℃下，经氮吹仪吹干后，用1.0mL乙腈0.1％甲酸溶液振荡溶解残渣，过0.22μm滤膜，得基质空白溶液；

将标准中间工作液用基质空白溶液稀释成浓度分别为2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL的基质标准工作溶液；

液相色谱测定：

将基质标准工作溶液采用C₁₈ 50mm×2.1mm(i.d)、粒度2.6μm的色谱柱，在色谱柱温度为40℃、进样量为5μL、以体积浓度为0.1％的甲酸溶液和乙腈为流动相、流速为0.3mL/min的条件下在0min、4min、7min、7.01min、10min梯度洗脱，得到灭草松的参考保留时间；

流动相及梯度洗脱条件如下：

时间(min)	0.1％甲酸溶液/％	乙腈/％	流速(mL/min)
0	85	15	0.3
4	15	85	0.3
7	15	85	0.3
7.01	85	15	0.3
10	85	15	0.3

质谱测定：

在离子化模式为电喷雾负离子模式、质谱扫描方式为多反应监测、气帘气为30.0psi、雾化气为50.0psi、辅助加热气为55L/min、碰撞气为5.0psi、离子源喷雾电为-4500.00V、离子源温度为500℃的条件下，在基质标准工作溶液中选择1个母离子，2个子离子，进行质谱测定；

将步骤三得到的净化液进行液相色谱和质谱测定，净化液中灭草松的的保留时间与基质标准工作溶液中灭草松的参考保留时间偏差在±2.5％之内；

且样品中组分定性离子的相对丰度与浓度接近的基质标准工作溶液中对应的定性离子的相对丰度进行比较，在相对离子丰度大于50％、允许的相对误差±20％，相对离子丰度大于20％小于50％、允许的相对误差±25％，相对离子丰度大于10％小于20％、允许的相对误差±30％，相对离子丰度小于等于10％、允许的相对误差±50％的条件下，则可判定为样品中存在对应的待测物；

五、定量测定：

对浓度分别为2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL的基质标准工作溶液进样，以被测物峰面积为纵坐标，基质标准工作溶液浓度为横坐标绘制标准工作曲线，用基质标准工作曲线对步骤三的净化液进行定量，步骤三的净化液中待测物的响应值均应在仪器测定的线性范围内，如果超出浓度为50ng/mL基质标准工作溶液的线性最高点，则对步骤三的净化液进行稀释；

六、空白试验：

提取：

取50mL离心管，加入0.3mL浓度为1mol/L的盐酸溶液、20mL乙腈，用均质器以15 000r/min均质2min，在5 000r/min下离心5min后，将上清液转移至50mL容量瓶中，残留物再用20mL乙腈重复提取一次，合并提取液于同一容量瓶中，并用水定容至50mL，移取10mL提取液，用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至6.0～8.0，并在10000r/min离心5min，得提取液，待净化；

净化：

在流速为1mL/min～2mL/min的条件下将提取液全部转移到已依次用3mL甲醇、3mL水活化后的强阴离子交换固相萃取柱中，弃去流出液，依次用3mL水、3mL甲醇淋洗净化柱，最后用3mL体积浓度为2％的甲酸甲醇溶液洗脱，在流速为1mL/min～2mL/min的条件下，收集洗脱液于15mL刻度离心管中，洗脱液在45℃下，经氮吹仪吹干后，用1.0mL乙腈0.1％甲酸溶液振荡溶解残渣，过0.22μm滤膜，得到净化液，供液相色谱-质谱测定；

七、结果计算和表述：

样品中灭草松的残留含量，按式(1)计算，计算结果需扣除空白值：

式中：

X_i——样品中被测物灭草松含量，单位为微克每千克；

C_i——净化液中被测物的浓度，单位为纳克每毫升；

V——净化液最终定容的体积，单位为毫升；

m——最终净化液所代表的均匀试样质量，单位为克。

2.液相色谱-质谱/质谱法测定植物源食品中灭草松残留量的方法，其特征在于液相色谱-质谱/质谱法测定植物源食品中灭草松残留量的方法按照以下步骤进行：

一、取大米、玉米、大豆或茶叶样品500g，用粉碎机粉碎，混匀，于常温下保存，得到均匀试样；

二、提取：

称取1～5g均匀试样，置于50mL离心管中，加入0.3mL浓度为1mol/L盐酸溶液、10mL水浸泡30min，加入20mL乙腈，用均质器以15 000r/min均质2min后，在5 000r/min下离心5min，将上清液转移至50mL容量瓶中，残留物再用20mL乙腈重复提取一次，合并提取液于同一容量瓶中，并用水定容至50mL，移取10mL提取液，用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至6.0～8.0，并在10000r/min离心5min，待净化；

三、净化：

在流速为1mL/min～2mL/min的条件下将步骤二所得样液全部转移到已依次用3mL甲醇、3mL水活化后的强阴离子交换固相萃取柱中，弃去流出液，依次用3mL水、3mL甲醇淋洗净化柱，最后用3mL体积浓度为2％的甲酸甲醇溶液洗脱，在流速为1mL/min～2mL/min的条件下，收集洗脱液于15mL刻度离心管中，洗脱液在45℃下，经氮吹仪吹干后，用1.0mL乙腈0.1％甲酸溶液振荡溶解残渣，过0.22μm滤膜，得到净化液，供液相色谱-质谱测定；

四、定性测定：

称取灭草松用乙腈配制成1.0mg/mL的标准储备液，取标准储备液2mL至100mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配制成浓度为2μg/mL标准中间工作液；

将没有灭草松农药检出的苹果、番茄、菜豆、萝卜、甘蓝、香菇或洋葱样品500g，将样品可食部分切碎后用捣碎机将样品加工成浆状，混匀，得均匀试样；

提取：称取5g均匀试样，置于50mL离心管中，加入0.3mL浓度为1mol/L的盐酸溶液、20mL乙腈，用均质器以15 000r/min均质2min，在5 000r/min下离心5min后，将上清液转移至50mL容量瓶中，残留物再用20mL乙腈重复提取一次，合并提取液于同一容量瓶中，并用水定容至50mL，移取10mL提取液，用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至6.0～8.0，并在10000r/min离心5min，待净化；

净化：在流速为1mL/min～2mL/min的条件下将步骤二所得样液全部转移到已依次用3mL甲醇、3mL水活化后的强阴离子交换固相萃取柱中，弃去流出液，依次用3mL水、3mL甲醇淋洗净化柱，最后用3mL体积浓度为2％的甲酸甲醇溶液洗脱，在流速为1mL/min～2mL/min的条件下，收集洗脱液于15mL刻度离心管中，洗脱液在45℃下，经氮吹仪吹干后，用1.0mL乙腈0.1％甲酸溶液振荡溶解残渣，过0.22μm滤膜，得基质空白溶液；

将标准中间工作液用基质空白溶液稀释成浓度分别为2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL的基质标准工作溶液；

液相色谱测定：

将基质标准工作溶液采用C₁₈ 50mm×2.1mm(i.d)、粒度2.6μm的色谱柱，在色谱柱温度为40℃、进样量为5μL、以体积浓度为0.1％的甲酸溶液和乙腈为流动相、流速为0.3mL/min的条件下在0min、4min、7min、7.01min、10min梯度洗脱，得到灭草松的参考保留时间；

流动相及梯度洗脱条件如下：

时间(min)	0.1％甲酸溶液/％	乙腈/％	流速(mL/min)
0	85	15	0.3
4	15	85	0.3
7	15	85	0.3
7.01	85	15	0.3
10	85	15	0.3

质谱测定：

在离子化模式为电喷雾负离子模式、质谱扫描方式为多反应监测、气帘气为30.0psi、雾化气为50.0psi、辅助加热气为55L/min、碰撞气为5.0psi、离子源喷雾电为-4500.00V、离子源温度为500℃的条件下，在基质标准工作溶液中选择1个母离子，2个子离子，进行质谱测定；

将步骤三得到的净化液进行液相色谱和质谱测定，净化液中灭草松的的保留时间与基质标准工作溶液中灭草松的参考保留时间偏差在±2.5％之内；

且样品中组分定性离子的相对丰度与浓度接近的基质标准工作溶液中对应的定性离子的相对丰度进行比较，在相对离子丰度大于50％、允许的相对误差±20％，相对离子丰度大于20％小于50％、允许的相对误差±25％，相对离子丰度大于10％小于20％、允许的相对误差±30％，相对离子丰度小于等于10％、允许的相对误差±50％的条件下，则可判定为样品中存在对应的待测物；

五、定量测定：

对浓度分别为2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL的基质标准工作溶液进样，以被测物峰面积为纵坐标，基质标准工作溶液浓度为横坐标绘制标准工作曲线，用基质标准工作曲线对步骤三的净化液进行定量，步骤三的净化液中待测物的响应值均应在仪器测定的线性范围内，如果超出浓度为50ng/mL基质标准工作溶液的线性最高点，则对步骤三的净化液进行稀释；

六、空白试验：

提取：

取50mL离心管，加入0.3mL浓度为1mol/L的盐酸溶液、20mL乙腈，用均质器以15 000r/min均质2min，在5 000r/min下离心5min后，将上清液转移至50mL容量瓶中，残留物再用20mL乙腈重复提取一次，合并提取液于同一容量瓶中，并用水定容至50mL，移取10mL提取液，用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至6.0～8.0，并在10000r/min离心5min，得提取液，待净化；

净化：

在流速为1mL/min～2mL/min的条件下将提取液全部转移到已依次用3mL甲醇、3mL水活化后的强阴离子交换固相萃取柱中，弃去流出液，依次用3mL水、3mL甲醇淋洗净化柱，最后用3mL体积浓度为2％的甲酸甲醇溶液洗脱，在流速为1mL/min～2mL/min的条件下，收集洗脱液于15mL刻度离心管中，洗脱液在45℃下，经氮吹仪吹干后，用1.0mL乙腈0.1％甲酸溶液振荡溶解残渣，过0.22μm滤膜，得到净化液，供液相色谱-质谱测定；

七、结果计算和表述：

样品中灭草松的残留含量，按式(1)计算，计算结果需扣除空白值：

式中：

X_i——样品中被测物灭草松含量，单位为微克每千克；

C_i——净化液中被测物的浓度，单位为纳克每毫升；

V——净化液最终定容的体积，单位为毫升；

m——最终净化液所代表的均匀试样质量，单位为克。