[发明专利]一种抗苦荞金属硫蛋白FtMT单克隆抗体及其制备方法和应用

说明书

本发明属单克隆抗体制备技术领域，提供一种抗苦荞金属硫蛋白FtMT单克隆抗体及其制备方法和应用。该抗体通过含多羟基化合物和非离液序列盐洗脱实现与抗原FtMT解离的抗苦荞金属硫蛋白单克隆抗体，即抗FtMT PR‑mAb。可以在多羟基化合物如乙二醇、丙二醇及丁二醇和非离液序列盐如硫酸铵、氯化钠等的存在下，在非强酸性、非高盐的温和条件实现与抗原FtMT的解离。作为一种良好的免疫亲和配基应用于FtMT免疫亲和层析中，即可以保证目的蛋白特征和活性，又可减少对单抗的破坏、延长免疫亲和柱的寿命，更重要的是保证了纯化过程中FtMT的MT/金属离子复合物存在形式，实现了具有天然结构和功能的非融合MT的高效分离纯化。

技术领域

本发明属于单克隆抗体制备技术领域，具体涉及一种抗苦荞金属硫蛋白FtMT单克隆抗体及其制备方法和应用。

背景技术

MT（Metallothionein，MT）是一类广泛存在于生物界，分子量较低(6~7 kDa)，富含半胱氨酸，缺少芳香族氨基酸和组氨酸，且能与多种重金属结合的热稳定胞内蛋白质。研究证实多数物种内存在1个以上具有不同氨基酸组成和特性的MT亚型（isoform）。MT蛋白存在的广泛性、多态性，高度诱导性以及保守性，暗示其在生物体内具有极其重要的生理功能。现有研究结果已证实，MT在生物体体内主要负责解除重金属毒性；参与体内必需金属元素平衡；清除自由基、拮抗电离辐射；参与激素和发育过程调节，增强机体对各种应激的反应；抑制细胞凋亡，在肿瘤的发生、发展中发挥重要作用，还与细胞的增殖、分化和凋亡密切相关。然而迄今关于不同来源的MT8营业款或MT亚型在体内生理进程中执行何种特定的生物学功能还尚未阐明。

作为一种可以特异性结合金属离子的功能蛋白质，MT的金属结合能力特性是其发挥诸多生物学功能的基础；不同来源的MT或者MT亚型具有特定的金属结合特性或偏好，是其执行体内特定生理功能的决定因素。规模化制备具有天然结构和功能的MT，是其功能研究和应用开发的前提。

由于活性巯基含量较高，极易被氧化，导致MT的分离纯化非常困难。近年来随着基因重组技术的发展，多种来源的MT蛋白实现了重组表达，为MT的研究和利用提供了可能。然而，MT必须与GST、MBP、SUMO等促溶标签融合以防止胞内降解和包涵体形成，或者与外膜蛋白LamB、OmpA或跨膜蛋白PAL融合表达至细胞外膜来降低胞内毒性和提高可溶性，才可实现重组表达。这两种重组表达策略都需要融合较大的外源基因片段而实现，需要复杂的蛋白酶切处理才能获得非融合MT蛋白，容易对MT的功能及结构产生较大影响。具有天然金属结合特性的非融合MT重组蛋白的重组表达，由于半衰期短、具有细胞毒性和易于形成包涵体等问题而难以实现。

专利ZL 201310430331.4以含有phoA启动子及可分泌至细胞周质的信号肽序列的phoA质粒作为表达载体，建立了一种可溶性重组华溪蟹金属硫蛋白（rcMT）的制备方法，较好的解决了小分子MT蛋白可溶性表达的技术问题，但仍然需要融合6His标签来达到快速纯化的目的。然而，即便是6His的小肽纯化标签，也会对MT的金属结合特性产生较大的影响（Tarasava, K., Johannsen, S., Freisinger, E. Solution structure of thecircular γ-domain analog from the wheat metallothionein E(c)-1. Molecules,2013, 18(11): 14414-14429）。

无任何纯化标签的非融合MT，必须通过丙酮梯度粗提、琼脂糖凝胶分离及离子交换层析一系列复杂的操作实现分离纯化。过于繁杂的操作不仅耗时费力，同时在操作过程中MT易被氧化而破坏（Pérez-Rafael, S, Mezger, A, Lieb, B, et al. The metalbinding abilities of Megathura crenulata metallothionein (McMT) in the frameof Gastropoda MTs. J Inorg Biochem, 2012, 108:84-90）。