[发明专利]一种抗苦荞金属硫蛋白FtMT单克隆抗体及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种抗苦荞金属硫蛋白FtMT单克隆抗体抗FtMT PR-mAb的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）制备抗原：将苦荞金属硫蛋白FtMT编码区基因Accession:KY643823.1亚克隆至phoA表达质粒，利用质粒的phoA启动子和分泌信号序列，在低磷培养基诱导下分泌至周质，表达可溶性FtMT-6His融合蛋白，用镍柱亲和层析纯化获得FtMT-6His融合蛋白；

（2）动物免疫：以重组FtMT-6His作为免疫蛋白，与Quick Antibody-Mouse5W水溶性免疫佐剂1:1快速混合后，按免疫剂量25 μg/100 μL，于小鼠小腿肌肉注射，免疫5~6周龄雌性BALB/c小鼠； 3周后按同样方式加强免疫1针；5周后，采尾血进行间接ELISA检测；当血清滴度达到1:10⁴~1:10⁷范围内，腹腔注射冲击免疫25 μg/500 μL；

（3）细胞融合：选取鼠脾细胞，与骨髓瘤细胞利用PEG1500试剂进行体外融合，以FtMT-6His作为包被抗原，利用间接非竞争ELISA法筛选分泌抗FtMT的杂交瘤细胞株；同时用含His-tag的重组IGF蛋白作无关抗原做交叉筛选，排除针对His-tag表位的假阳性；按抗体亚类鉴定试剂盒操作说明进行亚类鉴定；

（4）mAb腹水制备及鉴定：以液体石蜡作为致敏剂，采用体内诱生法制备腹水，利用疏水电荷层析HCIC和Protein A 亲和层析相结合的方法纯化腹水；纯化的样品经12% SDS-PAGE和Western blot法鉴定分析；

（5）ELISA-elution筛选：以FtMT-6His蛋白作为筛选抗原，采用“ELISA-elution”方法筛选抗FtMT PR-mAb：96孔酶标板，pH9.6碳酸盐缓冲液包被FtMT-6His，10μg/ml，100μl/孔，4℃保存过夜经PBSB洗板后加明胶封闭；加入抗体样品100μl/孔，37℃孵育1.5h，PBSB洗板后加入polyol洗脱液或对照洗脱液室温孵育20min；PBST洗板甩干后，加入1:5 000稀释的山羊抗小鼠IgG-HRP为二抗，以邻苯二胺OPD溶液为反应底物，2M H₂SO₄ 30μl/孔终止反应后，492 nm处酶标仪测定；经polyol洗脱液洗脱后，其信号降低50%以上，即为目的抗FtMTPR-mAb。

2.根据权利要求1所述的一种抗苦荞金属硫蛋白FtMT单克隆抗体抗FtMT PR-mAb的制备方法，其特征在于：步骤（5）中所述polyol洗脱液为：40%丙二醇+0.75 M (NH4)₂SO₄，50 mMTris-HCl，pH 7.9；所述对照洗脱液为50 mM Tris-HCl，pH 7.9。