[发明专利]用于特异性吸附重金属铅的表面展示工程菌及构建方法和应用

说明书

本发明涉及用于特异性吸附重金属铅的表面展示工程菌及构建方法和应用；以冰晶核蛋白N端序列为锚定载体，通过柔性连接肽将铅结合蛋白展示在大肠杆菌细胞外膜表面，构建特异性铅结合蛋白表面展示基因工程菌。包括PbrR表面展示工程菌BL21(pR‑FL)、PbrR691表面展示工程菌BL21(pR691‑FL)和PbrD表面展示工程菌BL21(pD‑FL)。本发明中提供的基因工程菌可以高效地吸附水环境中的铅离子，且在混合金属离子共存条件下也具有对铅离子绝对的选择特异性。这种表面展示细胞吸附剂培养简单，易于获得，吸附周期短，且安全有效，十分便捷，为未来重金属的去除与回收提供了新技术和新思路。

技术领域

本发明涉及用于特异性吸附重金属铅的表面展示工程菌及构建方法和应用；涉及一种特异性的铅结合蛋白表面展示工程菌的构建方法，并利用该方法构建的用于铅离子吸附的表面展示工程菌，提供工程菌在重金属吸附方面的应用，属于分子生物学及基因工程菌改造领域。

背景技术

如今世界经济的快速发展，使工业化进程推进过程中的排污问题越来越严重，也使重金属污染问题越来越受到全球关注。铅是一种天然存在于地壳中的剧毒重金属。铅污染对环境造成的危害巨大：首先，农作物在含铅土壤中生长可能会导致生长不良或大幅减产；其次，铅不可降解，具有神经毒性，是一种严重危害人体健康的重金属元素，在体内的量超过一定水平就会对健康引起损害。利用传统的物理化学方法治理重金属污染过程虽取得一定成效，但对设备的要求极高，造成的修复成本也高，且修复工艺复杂，还要求投入大量的人力和物力，对重金属的选择缺乏特异性。而生物修复兼具了去除效率高，价格低廉，操纵简单，吸附效率高，对环境影响作用小等优势，尤其是近年来表面展示技术的出现，通过基因工程手段将特定蛋白固定在细胞外膜上，实现某一种或某一类重金属离子在细胞外被结合并达到去除的目的，在重金属吸附与去除领域得到广泛应用。

经研究发现，耐金属贪铜菌CH34(Cupriavidus metallidurans CH34)是目前唯一一个已被证明含有特殊的铅离子调控机制的细菌，与铅离子结合有关的基因几乎全部位于pbr操纵子上，而且，操纵子内的全部相关基因(pbrTRABCD)的表达均受到一种来自MerR家族的PbrR蛋白的调控。虽然C.metallidurans CH34对铅离子具有特异性识别与富集能力，但该菌不易获得，对其基因组和蛋白组的信息研究有限，且细胞对Pb²⁺的吸附能力不高，铅离子需要跨过细胞膜进入胞内才能实现固定，对细胞损害大，不适宜在高浓度含铅环境下应用。

重组基因技术的不断进步促进了基因工程的发展，以基因工程的思想改造菌种成为一种达到定向目的的手段。大肠杆菌(Escherichia coli)作为典型的的实验室模式菌株，代谢途径清楚，无内生质粒，可用作基因工程改造的优良底盘细胞，构建表面展示工程化菌株，作为表面细胞吸附剂用于重金属铅的去除。有研究者将PbrR蛋白与LPP-OmpA的融合蛋白展示在大肠杆菌细胞表面，使工程菌富集铅离子的能力相较于出发菌株得到提高，但是吸附能力却十分有限，而且绝大多数对铅的特异性吸附都依赖于PbrR，蛋白可选择性单一。因此，现阶段需要扩大特异性铅离子结合蛋白研究库，提供更多具有特异性铅结合能力的基因工程菌，实现对环境中铅离子的更高容量吸附。

作为优选，本研究从耐金属贪铜菌中选出三种非膜蛋白PbrR，PbrR691及PbrD，以冰晶核蛋白INP的N端序列为锚定蛋白，通过柔性连接肽以融合蛋白的形式在E.coli BL21(DE3)中分别构建了三株用于特异性吸附重金属铅的表面展示工程菌，并具备优良的铅离子结合能力，既避免了铅离子进入细胞产生的毒害作用，又解决了在现有研究中铅结合蛋白选择单一，吸附效率不高等出现的瓶颈问题。

发明内容