[发明专利]一种利用石墨烯多重信号放大SPR传感测定双酚A的方法

权利要求书

1.一种利用石墨烯多重信号放大SPR传感测定双酚A的方法，其特征在于，其包括步骤：

S1:试样准备

使用磁性石墨烯为吸附剂，对待测样品中的双酚A进行吸附富集、并用洗脱液洗脱，将洗脱下来的双酚A定容，得到待测试样；

S2:对SPR芯片进行修饰：将SPR芯片的贵金属片表面清洗干净，并在贵金属片表面连接羧基化氧化石墨烯；

所述SPR芯片的贵金属片为金片，具体步骤为：

步骤1：采用体积比为H₂O₂:H₂SO₄=1:3配制成piranha溶液，在室温下浸泡SPR芯片的金片，去除金片表面的有机物，用去离子水清洗、无水乙醇清洗，最后氮气吹干；其中H₂O₂为质量百分含量30%的双氧水；

步骤2：将所述SPR芯片的金片浸泡到巯基丙酸MPA的醇溶液中，放置过夜，取出并用乙醇冲洗金片以去除多余的巯基丙酸MPA，用去离子水冲洗以去除多余的醇，取出后氮气吹干金片；通过浸泡，巯基丙酸MPA与金片形成金硫键并引入带负电荷的羧基；

步骤3：将所述SPR芯片的金片浸泡到聚（烯丙胺·盐酸）PAH溶液中，取出后用去离子水冲洗，氮气吹干金片；通过浸泡和静电作用，使金片表面连接带正电荷的聚（烯丙胺·盐酸）PAH；

步骤4：将带有正电荷的金片浸泡在羧基化氧化石墨烯的分散液中，通过浸泡和聚（烯丙胺·盐酸）PAH的静电作用，使羧基化氧化石墨烯连接到金片表面；

S3:利用固定在SPR芯片贵金属表面的羧基化氧化石墨烯连接固定双酚A的全抗原BPA-BSA，固定BPA-BSA的方法为：

将SPR芯片及金片装入传感器中，以1-乙基3-（3-二甲氨基）碳二亚胺盐酸盐EDC溶液和N-羟基琥珀酰亚胺酯NHS溶液对芯片表面的羧基进行活化5-10min; 以pH=4-5的醋酸盐缓冲溶液为耦合缓冲溶液，用所述耦合缓冲液配制 BPA-BSA的溶液反应15-30min，以乙醇胺为封闭液反应5-20min，以0.05 mol/L的NaOH溶液为再生液再生1-3min，依次重复循环1-3次，使BPA-BSA与SPR芯片的金片表面带羧基的氧化石墨烯连接，实现BPA-BSA的固定化；

S4:基于间接竞争法利用SPR免疫传感测定待测试样中双酚A的浓度：将含BPA的待测试样和BPA的单克隆抗体BPA-mAb溶液混合进样，待测试样中的BPA与被固定在SPR芯片表面的BPA-BSA共同竞争BPA-mAb，SPR产生的信号与待测试样中BPA的浓度呈反比。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1中，磁性石墨烯按照如下方法制备得到：以纳米石墨烯粉、二价铁铁盐、三价铁铁盐为原料，其中二价铁和三价铁的摩尔比为1:2；向所述原料中加入浓盐酸后，超声脱氧并充分分散于超纯水与无水醇的混合溶剂中，机械搅拌12-24h，加入浓氨水调节pH10，在加热条件下继续搅拌，得到沉淀物，分离该沉淀物；加入超纯水和无水醇清洗，并采用磁分离器去除无磁性杂质，将所得物分散到无水醇中，低温烘干，即得到磁性石墨烯。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1中：采用磁性石墨烯为吸附剂，在pH为酸性条件下对待测样品中的双酚A进行吸附富集，吸附时间为4-10min，采用乙腈为洗脱液，将被磁性石墨烯吸附的双酚A洗脱下来，氮气吹干定容至100-250μL。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S3中，活化时，EDC浓度为0.4 mol/L，NHS浓度为0.1 mol/L，活化时间为7min；耦合缓冲溶液pH为4.5；其中用所述耦合缓冲液配制BPA-BSA的溶液反应20min，以pH8.5的乙醇胺为封闭液反应10min，以0.05 mol/L的NaOH溶液为再生液再生2min。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S3中，在固定BPA-BSA时，BPA-BSA浓度为100μg/mL，此时SPR的响应值为605.46m°。