[发明专利]用于肝癌早期诊断的检测甲胎蛋白异质体AFP-L3的ELISA试剂盒及检测方法

说明书

本发明涉及一种用于肝癌早期诊断的检测AFP‑L3的ELISA试剂盒及检测方法，该试剂盒包括AFP‑L3标准品、AFP单克隆抗体包被的酶标板、生物素标记的橙黄网孢盘菌凝集素、链霉亲合素标记的辣根过氧化物酶(SA‑HRP)、稀释液、洗涤液、封闭液、TMB显色液、终止液。采用该试剂盒进行检测的方法为：在AFP单克隆抗体包被的酶标板中加待测样品，然后加生物素标记的橙黄网孢盘菌凝集素，随后加链霉亲合素标记的辣根过氧化物酶；再加入显色液，最后加入终止液终止反应，并采用酶联检测仪测定吸光度值。本发明的试剂盒直接通过凝集素代替二抗对AFP‑L3进行检测，使AFP‑L3的检测更加简便、快捷。

技术领域

本发明涉及一种用于肝癌早期诊断的检测甲胎蛋白异质体(AFP-L3)的ELISA试剂盒及检测方法。

背景技术

肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是世界第六大常见的恶性肿瘤，在肿瘤中的致死率位居第三。2012年全球登记在册的肝癌的新增病例有782500人，死亡人数约745500人，其中在中国新增病例和死亡人数占半数。HCC患者早期常无明显的临床症状，致使大多数患者直到疾病的中晚期才被发现，从而往往错过最佳的治疗时间。HCC的早期诊断不仅可以提高疗效，还可以极大程度的提高患者五年生存率，并改善其生存质量。

一直以来，我国利用甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)和超声检查对易发生HCC的高危人群进行初步筛查。AFP的灵敏度和特异度不足，在慢性肝炎、肝硬化等肝脏慢性疾病中也会有不同程度的升高，且并非所有HCC患者中均有升高。

AFP分子量约为70KD，在胎儿时期高表达，出生后血清AFP降至健康成人水平，浓度小于20μɡ/L的一种单链糖蛋白。AFP作为一个糖蛋白分子，具有一个公认的N糖位点，其糖链部分约占其总量的4％。由于糖链存在微不均一性，已发现AFP有16种糖肽，在不同疾病状态有不同的糖型组合。其中甲胎蛋白异质体(AFP-L3)是指AFP的氨基酸序列相同而糖链结构不同的一个亚型，利用扁豆凝集素将AFP分为三个亚种，其中AFP-L1不与LCA结合，在肝硬化、乙肝病毒感染时升高；AFP-L2与LCA具有中度结合力，在孕妇或者妇科肿瘤中会有升高；AFP-L3与LCA具有高结合力，是由癌变的肝脏细胞产生。美国食品药品监督管理局于2005年批准将AFP-L3用于HCC的临床诊断。AFP-L3不仅可以用于HCC的早期诊断和鉴别诊断，还可以用于疗效评估及复发监测。

目前AFP-L3的检测方法有亲和免疫交叉电泳技术、亲和印迹技术、亲和层析、微量离心柱亲和吸附法以及微全检测技术等。这些方法有的已经应用于临床，有的还停留在科研阶段，但是它们检测的根本原理都是需先将AFP-L3从总AFP中分开后再进行测定，因此操作十分繁琐，导致无法高通量应用，同时检测成本较高，不适合市场大规模运用。基于临床研究和市场应用的需求，迫切需要开发一种可作为AFP-L3定量检测的简便、快速、有效、低成本的检测手段。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于肝癌早期诊断的AFP-L3的ELISA检测试剂盒及其检测方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

本发明的目的通过如下技术方案实现：

一种用于肝癌早期诊断的定量检测AFP-L3的ELISA试剂盒，所述的ELISA试剂盒包括：(A)AFP-L3标准品；(B)AFP单克隆抗体包被的酶标板；(C)生物素标记的橙黄网孢盘菌凝集素(AAL)、链霉亲合素标记的辣根过氧化物酶(SA-HRP)、稀释液、洗涤液、封闭液、TMB显色液以及终止液。

采用该试剂盒进行检测的方法包括以下步骤：在AFP单克隆抗体包被的酶标板中加待测样品，然后加生物素标记的橙黄网孢盘菌凝集素,随后加链霉亲合素标记的辣根过氧化物酶；再加入显色液，最后加入终止液终止反应，并采用酶联检测仪测定吸光度值。