[发明专利]用于肝癌早期诊断的检测甲胎蛋白异质体AFP-L3的ELISA试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种用于肝癌早期诊断的定量检测AFP-L3的ELISA试剂盒，其特征在于：所述的ELISA试剂盒包括：

(A)AFP-L3标准品；

(B)AFP单克隆抗体包被的酶标板；

(C)生物素标记的橙黄网孢盘菌凝集素、链霉亲合素标记的辣根过氧化物酶、稀释液、洗涤液、封闭液、TMB显色液以及终止液。

2.根据权利要求1所述的用于肝癌早期诊断的定量检测AFP-L3的ELISA试剂盒，其特征在于：所述AFP-L3标准品的制备方法为：称取1000μg AFP标准品，溶于1mL的浓度为0.01mol/L且pH为7.4的PBS缓冲液，吸取600μL加入到小扁豆凝集素亲和吸附离心管中，室温静置10min，吸取1.2mL清洗液加入离心管中，3000r室温下离心20s，弃去离心液体，加入600μL洗脱液到上部离心管，3000r室温下离心收集离心柱外管液体，即所需要的AFP-L3标准品。

3.根据权利要求1所述的用于肝癌早期诊断的定量检测AFP-L3的ELISA试剂盒，其特征在于：所述AFP单克隆抗体包被的酶标板的制备过程为：取1mg/mL的AFP单克隆抗体用包被液以1:800的比例稀释后加入酶标板各孔，每孔100μL，4℃包被过夜；随后甩去酶标板孔内液体，采用洗涤液PBST浸泡3min，反复洗涤3次，拍干酶标板内液体后用封闭液，200μL/孔，室温孵育30min，再次洗板3次，甩干后拍干，每孔加入100μL PH为4.5，浓度为20mmol/L的醋酸钠，4℃孵育30min后甩干，随后加入新鲜配置的25mmol/L NaIO₄溶于PH为4.5的醋酸钠中，每孔100μL，4℃避光孵育1.5h后20mmol/L醋酸钠洗涤3次，每次5min，拍干后加入1mmol/L MPBH每孔100μL，18-22℃，避光孵育2h后加入1mmol/L Cys-Gly溶液每孔100μL，4℃避光孵育过夜；最后采用洗涤液PBST洗3次板，每次5分钟，甩干后晾干，即获得AFP-L3单克隆抗体包被的酶标板。

4.根据权利要求1所述的用于肝癌早期诊断的定量检测AFP-L3的ELISA试剂盒，其特征在于：所述稀释液为PBS缓冲液；

所述PBS缓冲液的配制方法为：将0.2700ɡ KH₂PO4、1.4200ɡ Na₂HPO₄、8.0000ɡ NaCl、0.2000ɡ KCl、加去离子水约800mL，充分搅拌溶解，然后加入浓盐酸调节PH至7.4，并定容至1000mL，高压灭菌，4℃保存。

5.根据权利要求1所述的用于肝癌早期诊断的定量检测AFP-L3的ELISA试剂盒，其特征在于：所述洗涤液为PBST缓冲液；所述PBST缓冲液的配制方法为：将8.0g NaCl、0.2g KCl、0.26g KH₂PO₄、2.9g Na₂HPO₄·12H₂O、0.5mL Tween-20、0.2g NaN₃，加蒸馏水溶解后定容至1000mL，高压灭菌，4℃保存。

6.根据权利要求1所述的用于肝癌早期诊断的定量检测AFP-L3的ELISA试剂盒，其特征在于：所述封闭液为含1％BSA的PBST缓冲液，配置好的封闭液经过滤除菌后，4℃保存。

7.根据权利要求1所述的用于肝癌早期诊断的定量检测AFP-L3的ELISA试剂盒，其特征在于：所述TMB显色液为磷酸盐-枸橼酸缓冲液。

8.根据权利要求1所述的用于肝癌早期诊断的定量检测AFP-L3的ELISA试剂盒，其特征在于：所述终止液为将90mL蒸馏水，逐渐滴加入10mL 98％浓硫酸中所配制而成的溶液。

9.利用权利要求1-8任意一项所述的ELISA试剂盒定量检测AFP-L3的方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)将AFP-L3标准品用稀释液分别按1:2、1:8、1:32、1:128、1:512、1:2048、1:4096、1:8192梯度进行倍比稀释；

2)在AFP单克隆抗体包被的酶标板的微孔中加待测血清样品，同时设阳性对照、阴性对照和空白对照，还有1)中不同溶度的标准品，均100μL/孔，振荡混匀，37℃孵育30min，PBST洗3次板，每次5min，拍干；

3)生物素标记的AAL孵育：每孔加入50μL经1:8000稀释的生物素标记的AAL，37℃孵育30min，洗板同上；

4)链霉亲合素标记的辣根过氧化物酶孵育：每孔加入50μL经1:8000稀释的亲和素标记的HRP，37℃孵育30min，洗板同上；

5)显色：加入TMB显色液，100μL/孔，37℃避光孵育20min；

6)终止：各孔加50μL终止液终止反应，混匀后10min内在450nm波长处测定吸光度值；

7)制作标准曲线：分别测定按1:2、1:8、1:32、1:128、1:512、1:2048、1:4096、1:8192梯度进行倍比稀释AFP-L3标准品的OD值作AFP-L3的蛋白标准曲线，其中以标准品稀释倍数相应浓度的对数为横坐标，标准品测定的OD值为纵坐标；

8)根据标准曲线计算待测样品AFP-L3浓度。