[发明专利]一种RNA激活Cas14a酶附带切割效应的方法

说明书

本发明可用于分析检测及基因编辑领域，能够相应的提供一种RNA激活Cas14a“附带切割”活性即可被激活成为非特异性的ssDNase的方法，解决RNA不能激活Cas14a酶的附带切割活性的问题，拓展Cas14a酶由DNA到RNA的应用范围。

技术领域

本发明涉及一种RNA激活CRISPR-Cas14a酶附带切割效应的方法，可用于分析和基因编辑领域。

背景技术

CRISPR（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats）被称为规律成簇间隔短回文重复，是细菌用以保护自身对抗病毒的一个系统[1]。目前发现的CRISPR相关联CRISPR-Cas系统效应蛋白分为两大类：第一类是CRISPR-Cas系统利用多蛋白复合物，第二类是CRISPR-Cas系统利用单蛋白效应物[2]。在第2类CRISPR系统中，一个具有多功能域的100-200 KDa Crispr Associated protein(Cas)蛋白在RNA引导下进行DNA或RNA底物的结合和切割。CRISPR和CRISPR关联基因(CRISPR-Cas)具有的可编程的外切酶活性使其成为有效的核酸诊断工具。基于不同的效应蛋白家族，第二类系统可以分为3大类和9个亚型，其中II型的蛋白效应器Cas9与tracrRNA、引导crRNA组成效应复合物切割靶DNA[3]；V型系统的Cas12a不需要tracr RNA，其单独使用crRNA作为指导，向目标双链DNA中引入交错切割，一旦切割靶标，Cas12a的附带切割活性即可被激活，可以切割TTATT序列的DNA单链[4]；VI型效应器Cas13a是RNA引导的RNA酶，一旦RNA靶标与sgRNA相结合，Cas13a的“附带切割”活性即可被激活成为非特异性的RNase[5]。

CRISPR-Cas14酶是近期发现的一种新的CRISPR-Cas家族的蛋白,其分子量较小，具有靶向切割DNA的活性，本发明能够相应的提供一种RNA激活“附带切割”活性即可被激活成为非特异性的ssDNase的方法，对分析和基因编辑领域具有重要意义；

[1] Jackson, S. A.; McKenzie, R. E.; Fagerlund, R. D.; Kieper, S. N.;Fineran, P. C.; Brouns, S. J., CRISPR-Cas: Adapting to change. Science 2017,356 (6333).

[2] Shmakov, S.; Smargon, A.; Scott, D.; Cox, D.; Pyzocha, N.; Yan,W.; Abudayyeh, O. O.; Gootenberg, J. S.; Makarova, K. S.; Wolf, Y. I.;Severinov, K.; Zhang, F.; Koonin, E. V., Diversity and evolution of class 2CRISPR-Cas systems. Nat Rev Microbiol 2017, 15 (3), 169-182.

[3] Chen, J. S.; Doudna, J. A., The chemistry of Cas9 and its CRISPRcolleagues. Nature Reviews Chemistry 2017, 1 (10).

[4] Max A. English; Luis R. Soenksen; Raphael V. Gayet; Helena dePuig; Nicolaas M. Angenent-Mari; Angelo S. Mao2; Peter Q. Nguyen; Collins, J.J., Programmable CRISPR-responsive smart materials. Science 2019.