[发明专利]一种检测基于RNAi转基因植物双链RNA的试剂盒及其应用

说明书

本发明提供了一种检测基于RNAi转基因植物双链RNA的试剂盒及其应用，所述试剂盒包括引物探针组合物；所述引物包括如SEQ ID NO:1～2所示的核酸序列；所述探针包括如SEQ ID NO:3所示的核酸序列。本发明针对基于RNAi技术的转基因玉米品系双链RNA，设计了引物探针，并建立了一套逆转录芯片式数字PCR定量检测方法，所述方法的绝对定量限为2.5copies/μL，RSD为12.4％，检测低浓度实际样品达21.7copies/μL时，相对偏差为2.7％，RSD为14.6％，满足国际上转基因定量结果RSD≤25％的要求，用于基于RNAi技术转基因植物的定量检测，为我国相关转基因植物的安全评价提供了精确可靠的技术手段。

技术领域

本发明属于核酸检测技术领域，涉及一种检测基于RNAi转基因植物双链RNA的试剂盒及其应用，尤其涉及一种检测RNAi转基因玉米品系双链RNA的引物探针组合物、试剂盒、检测方法及其应用。

背景技术

近年来，随着生物技术及相关专业的发展，针对转基因作物的研究和应用愈发广泛，截止至2018年底，全球转基因作物种植面积已达1.917亿hm²；与此同时，各国家和地区对于转基因作物的安全管理也日趋严格，开始实施标识制度和系统化管理。

RNA干扰(RNAi，RNA interference)作为一种新兴的热门转基因生物技术，常指采用一些短链的双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)促使特异性mRNA降解，来高效阻断生物体内特异性基因的表达。该技术在基因功能研究领域发挥了重要作用，并被认为是极具应用潜力的育种新方法，已在转基因番茄、马铃薯等作物上实现了深入研究。由于RNAi技术存在沉默机制的特异性可能在传代、生长环境等过程中产生变化、沉默在物种间可能产生漂移或偶然性触发等因素，RNAi转基因作物的安全评价显得尤为重要，但是目前国内外尚未建立RNAi转基因植物的权威的评价及管理方法，这对我国转基因安全监管十分不利。因此，寻找到RNAi转基因植物的高效检测方法，对其进行精确定量意义重大。

目前，针对转基因产物定量检测主要依靠PCR技术。实时荧光定量PCR技术(real-time PCR)和普通PCR法相比灵敏度更高，并且能对基因拷贝数进行定量。CN 107858444 A公开了一种转基因水稻G6H1品系特异性定量PCR检测方法，包括以下步骤：A1、设计合成引物和荧光探针；所述引物的序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，所述荧光探针的序列如SEQ ID No.3所示；A2、制备G6H1品系的DNA模板稀释液；A3、配制定量PCR反应体系；A4、进行定量PCR检测，所述方法具有高效、灵敏、准确等优点，适合于转基因抗虫耐除草剂水稻G6H1及其制品的定量检测。但是，该荧光定量PCR方法是依靠Ct值和标准曲线进行相对定量的，对于低拷贝数和来源复杂样品的检测有很大的局限性。

随着PCR技术的不断发展，第三代数字PCR(digital PCR，dPCR)以其灵敏度高、绝对定量精确、检测线性范围宽、特异性好等优势脱颖而出。dPCR采用分散手段，将完整的PCR体系分散至成千上万个独立体系中，使得每个独立PCR体系中至多包含一个模板(实际样品中的模板数符合泊松分布)，并对这些体系是否发生了PCR反应进行检测从而达到精确的绝对定量。由于上述多种优势，dPCR技术在近年来飞速发展，已经多次被报导应用于转基因成分的定量检测实验研究中。CN 109971879 A公开了一种检测转基因大豆品系MON87705的PCR引物组合及应用。所述引物组合包括特异检测转基因大豆品系MON87705外源基因的引物对，其上游引物如SEQ ID No.1所示，下游引物如SEQ ID No.2所示。所述引物组合还包括特异检测转基因大豆品系MON87705外源基因的探针，其序列为SEQ ID No.3或其互补序列。所述引物组合在使用微滴式数字PCR方法检测待测样品时，特异性好，灵敏度(检测下限)为PCR扩增的反应体系中DNA模板的浓度0.025ng/μL，对转基因大豆品系MON87705外源基因成分的定性和定量检测具有十分重要的应用价值。但是，该技术方案设计的引物探针组合无法检测转基因作物中的双链RNA。