[发明专利]一种真菌荧光染色液及其制备方法

说明书

本发明涉及一种真菌荧光染色液及其制备方法，由以下原料组成：5‑羟基荧光素、真菌引物ITS4、促溶剂、抗干扰荧光助剂肌醇六磷酸钾、稳定剂、渗透剂、背景染料、去离子水。本发明真菌荧光染色液的制备方法包括，将5‑羟基荧光素和真菌引物ITS4溶于去离子水中，搅拌均匀后，缓慢加入促溶剂，轻轻搅拌充分溶解，然后置于37℃恒温摇床上，摇匀后获得溶液A；将抗干扰荧光助剂、稳定剂、渗透剂以及背景染料溶液溶于剩余去离子水中，搅拌均匀后，获得溶液B；将溶液A缓慢倒入溶液B中，搅拌均匀后即得真菌荧光染色液。本发明制备的真菌荧光染色液不仅简便快速、灵敏性高、辨识度高，且解决了荧光染色液使肺孢子菌着色困难的问题。

技术领域

本发明涉及一种真菌荧光染色液及其制备方法，属于医学临床检验中病原菌生物学检验技术领域。

背景技术

真菌广泛存在于自然界，而致病性真菌约有400余种。随着器官移植的大量开展及免疫抑制剂、肿瘤患者化疗药物、糖皮质类固醇激素的广泛使用，人类免疫缺陷病毒感染的高流行趋势、体内有创检查的大量开展，人口老龄化和糖尿病等慢性疾病患者的增多，真菌发病率和死亡率逐年增加，对人类健康的危害日趋严重。由于临床对很多真菌感染的微生物特性了解较少，加之真菌感染的临床表现多种多样，通常会出现误诊、漏诊，导致病情加重甚至危及生命。这就需要确实有效快速的早期诊断方法。

常见的真菌检测方法包括荧光染色、革兰氏染色、KOH湿片法、血清学方法、分子生物学法以及真菌培养，期中，荧光染色法是一种利用重组几丁质酶来检测人体各种标本中是否存在真菌有形成分的方法。真菌荧光染色液中，经过特殊荧光素标联的重组几丁质酶可以高亲和力与真菌细胞壁上的几丁质结合并发出荧光，在荧光显微镜下可以清楚的观察到真菌形态。荧光染色简便快速、灵敏性高、辨识度高，且适用范围广。

申请号为201710899393.8，发明名称为一种真菌荧光染色液及其制备方法中5-羧基荧光素的羧基与真菌核糖体核糖核酸间隔区引物4(ITS4)的核苷酸链两端的磷酸基团端氨基残基共价结合标记成荧光引物，在游离状态时该荧光引物形成茎环结构避免5-羧基荧光素衰退，在氢氧化钾溶液中快速进入真菌细胞与真菌核糖体核糖核酸基因间隔区(ITS)碱基发生特异性的结合，此时，茎环结构打开，露出5-羧基荧光素将真菌细胞标记荧光，另外，甘油、双磷脂酰甘油、抗坏血酸形成的抗荧光衰退保护层将露出5-羧基荧光素封闭式包裹阻止荧光衰退，使真菌样本能长期保存，用荧光显微镜在480nm波长下镜检观察背景为黑色，真菌发射出520nm波长的绿色荧光。

但实际检测过程中，荧光染色除了真菌外，动脉壁、肺泡和细支气管上的弹性纤维、外源性的植物纤维、脂肪滴、寄生虫等也可以发出亮蓝色的荧光，结合形态还是容易区分。造成假阴性的因素有未使用适合波长段的滤光片、标本图片太厚、染液量过少、染色时间过短、荧光猝灭物质存在等，现有荧光染色液使肺孢子菌着色困难。

发明内容

本发明针对上述问题，提供了一种真菌荧光染色液及其制备方法，本发明制备的荧光染色液不仅简便快速、灵敏性高、辨识度高，且解决了荧光染色液使肺孢子菌着色困难的问题。

本发明的技术方案如下：

一种真菌荧光染色液，由以下原料组成：

5-羟基荧光素、真菌引物ITS4、促溶剂、抗干扰荧光助剂肌醇六磷酸钾、稳定剂、渗透剂、背景染料、去离子水。

其中，促溶剂为氢氧化钠和氢氧化钾的混合物；稳定剂为山梨醇、渗透剂为二甲基乙酰胺；背景染料为染料溴百里酚蓝；优选的，促溶剂中氢氧化钠和氢氧化钾的重量比为1:1。

进一步的，本发明真菌荧光染色液，由以下重量份数的原料组成：

5-羟基荧光素0.005份、真菌引物ITS4 0.03份、促溶剂氢氧化钠和氢氧化钾按重量比为1:1的比例混合的混合物11份、抗干扰荧光助剂肌醇六磷酸钾1份、稳定剂山梨醇20份、渗透剂二甲基乙酰胺0.5份、背景染料溴百里酚蓝2份、去离子水60份。