[发明专利]一种装载shRNA的外泌体及其构建方法与应用

说明书

本发明公开了一种装载shRNA的外泌体及其构建方法与应用。本发明通过将可以有效沉默靶基因的shRNA序列克隆入表达载体，得到重组表达载体1；shRNA序列包括依次连接的靶序列、茎环结构序列和靶序列的互补序列；然后将能与所述的茎环结构特异性结合的蛋白A的基因与外泌体膜蛋白的基因连接，得到融合基因序列，再将所得的融合基因序列克隆入表达载体，得到重组表达载体2；最后将重组表达载体1、2同时转染细胞，培养转染后细胞，收集外泌体，即获得所述的装载shRNA的外泌体。该方法操作简单易行，工艺稳定，适用性好。所得外泌体中包载有大量shRNA，可以作为一种高效的药物传递系统。

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种装载shRNA的外泌体及其构建方法与应用。

背景技术

RNA干扰(RNAi)是有效沉默或抑制目标基因表达的过程，该过程通过双链RNA(dsRNA)使得目标基因相应的mRNA选择性失活来实现的。沉默机制可导致由小干扰RNA(siRNA)或短发夹RNA(shRNA)诱导实现靶mRNA的降解，或者通过小RNA(miRNA)诱导特定mRNA翻译的抑制。siRNA和shRNA都已用来基因治疗。其中短发夹RNA(shRNA)，包含一个环结构，可加工成siRNA发挥作用，也可通过与目标mRNA互补结合序列特异性地实现靶mRNA降解。shRNA比siRNA的优势包括能够使用病毒载体进行转染，克服了某些类型的细胞不能转染的难题，能选择使用诱导型启动子控制shRNA表达，能够与报告基因共表达。此外，它们能减少脱靶效应。

外泌体(exosomes)是由细胞分泌的直径为30～150nm的囊泡，细胞质膜凹陷形成的细胞内小泡，具有与细胞膜相同的膜结构，可以携带诸如RNA、蛋白质等大量成分，与细胞的生物学功能及细胞间的信号传递有着密切的关系。因其特殊的结构，相较人工合成的药物载体，外泌体作为药物载体进行药物运输有独特的优势，主要体现在外泌体的膜结构与细胞膜相同，可以提高药物进入细胞的效率，甚至可以透过血脑屏障，同时外泌体引起的有害免疫反应极低，有很好的渗透滞留(EPR)效应从而具有缓释效果等。目前已经尝试用外泌体携带siRNA、化学小分子药物等进行基因治疗和肿瘤治疗等研究。外泌体包载siRNA等小分子多采用将外泌体与小分子孵育的方式，包载率一般较低。

因此，如何实现外泌体对shRNA更高效的包载，是当前亟待解决研究的关键问题。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种装载shRNA的外泌体的构建方法。

本发明的另一目的在于提供一种装载shRNA的外泌体。

本发明的另一目的在于提供上述装载shRNA的外泌体的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种装载shRNA的外泌体的构建方法，包括如下步骤：

(1)设计、合成可以有效沉默靶基因的shRNA序列；将所述的shRNA序列克隆入表达载体，得到重组表达载体1；所述的shRNA序列包括依次连接的靶序列、茎环结构(Kt-loop)序列和靶序列的互补序列；

(2)将能与所述的茎环结构特异性结合的蛋白的基因与外泌体膜蛋白的基因连接，得到融合基因序列，再将所得的融合基因序列克隆入表达载体，得到重组表达载体2；

(3)将步骤(1)得到的重组表达载体1和步骤(2)得到的重组表达载体2同时转染细胞，培养转染后细胞，收集外泌体，即获得所述的装载shRNA的外泌体。

设计步骤(1)中所述的shRNA序列时，需通过构建包含所述的shRNA序列的重组表达载体，转染细胞，验证其具有沉默靶基因的功能。

步骤(1)中所述的茎环结构序列为GCTGACCCGAAAGGGCGTGATGC。

步骤(1)中所述的表达载体优选为pRNAT-U6.1/Neo。