[发明专利]一种装载shRNA的外泌体及其构建方法与应用

权利要求书

1.一种装载shRNA的外泌体的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)设计、合成可以有效沉默靶基因的shRNA序列；将所述的shRNA序列克隆入表达载体，得到重组表达载体1；所述的shRNA序列包括依次连接的靶序列、茎环结构序列和靶序列的互补序列；

(2)将能与所述的茎环结构特异性结合的蛋白的基因与外泌体膜蛋白的基因连接，得到融合基因序列，再将所得的融合基因序列克隆入表达载体，得到重组表达载体2；

(3)将步骤(1)得到的重组表达载体1和步骤(2)得到的重组表达载体2同时转染细胞，培养转染后细胞，收集外泌体，即获得所述的装载shRNA的外泌体；

步骤(1)中所述的茎环结构序列为GCTGACCCGAAAGGGCGTGATGC；

步骤(2)中所述的能与所述的茎环结构特异性结合的蛋白选自RNA结合蛋白L7Ae、NHP2核糖核蛋白样蛋白1、人核蛋白P56和人核蛋白P58中的至少一种；

步骤(2)中所述的外泌体膜蛋白为CD63、CD81、CD9和TP01中的至少一种。

2.根据权利要求1所述的装载shRNA的外泌体的构建方法，其特征在于：

所述的RNA结合蛋白L7Ae的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；

所述的NHP2核糖核蛋白样蛋白1的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；

所述的人核蛋白P56的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；

所述的人核蛋白P58的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示；

所述的CD63的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示；

所述的CD81的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示；

所述的CD9的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示；

所述的TP01的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示。

3.根据权利要求1所述的装载shRNA的外泌体的构建方法，其特征在于：

所述的RNA结合蛋白L7Ae的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

所述的NHP2核糖核蛋白样蛋白1的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

所述的人核蛋白P56的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；

所述的人核蛋白P58的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；

所述的CD63的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；

所述的CD81的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示；

所述的CD9的核苷酸序列如SEQ ID NO 16所示；

所述的TP01的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示。

4.根据权利要求1所述的装载shRNA的外泌体的构建方法，其特征在于：

步骤(2)中所述的连接为通过接头连接，连接的顺序为蛋白A的基因片段-接头-外泌体膜蛋白基因片段；

所述的接头的核苷酸序列为：

GGTGGAGGTGGCAGCGGAGGAGGTGGGTCCGGCGGTGGAGGAAGC。

5.根据权利要求1所述的装载shRNA的外泌体的构建方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的表达载体为pRNAT-U6.1/Neo；

步骤(2)中所述的表达载体为pCDNA3.4。

6.根据权利要求1所述的装载shRNA的外泌体的构建方法，其特征在于：

步骤(3)中，在转染细胞时，重组表达载体1和重组表达载体2的数量比为1～2:1～2。

7.一种装载shRNA的外泌体，其特征在于：根据权利要求1～6任一项所述的构建方法得到。