[发明专利]一种利用转基因斑马鱼评价药物抗阿尔茨海默症药效的方法

权利要求书

1.一种利用转基因斑马鱼评价药物抗阿尔茨海默症药效的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)转基因斑马鱼的构建

首先构建含有阿尔兹海默症相关基因序列的目标载体，再通过斑马鱼胚胎显微注射得到荧光标记该基因的转基因斑马鱼模型，将阳性胚胎培养至成鱼，即为F₀代转基因斑马鱼；

(2)转基因斑马鱼胚胎的培养

将转基因斑马鱼配种后，收集受精鱼卵，去除死卵和杂质，置于培养皿中，加入胚胎培养液后放入恒温培养箱中进行培养，得到转基因的斑马鱼幼鱼；

(3)分组与给药

设置野生型对照组、转基因组和药物不同浓度处理组，其中，野生型对照组采用野生型的斑马鱼幼鱼维持在斑马鱼系统循环水中，转基因组采用转基因的斑马鱼幼鱼维持在斑马鱼系统循环水中，药物不同浓度处理组采用转基因的斑马鱼幼鱼暴露于药物不同浓度的溶液中，当使用斑马鱼系统循环水以外的溶媒溶解药物，则增设溶媒组，溶媒组暴露于对应浓度的溶媒中；

(4)行为轨迹分析

药物作用后，使用斑马鱼行为轨迹分析系统，设置实验条件参数，观察和分析各组斑马鱼行为轨迹，使用速度相关变量进行定量分析；

(5)脑病理形态研究

行为轨迹分析后，每组选择多个样本，麻醉后于冰上快速解剖，分离鱼脑，进行超微结构病理分析；

(6)生化指标检测

将参照步骤(5)所述方法得到的鱼脑制备成组织匀浆，采用分子生物学方法测定阿尔茨海默症相关指标含量变化。

2.根据权利要求1所述的利用转基因斑马鱼评价药物抗阿尔茨海默症药效的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的阿尔兹海默症相关基因是从GeneCards获得的，与阿尔兹海默症相关性分数均大于100。

3.根据权利要求1所述的利用转基因斑马鱼评价药物抗阿尔茨海默症药效的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的转基因斑马鱼为纯合子，制备方法为：将步骤(1)得到的雌性F₀代转基因斑马鱼与野生型雄性斑马鱼配种，得到F₁代，将F₁代斑马鱼成鱼自交，通过剪尾鳍测序，筛选出杂合子，自交得到F₂代，自交得到的后代通过剪尾鳍测序，筛选纯合子的转基因斑马鱼。

4.根据权利要求1所述的利用转基因斑马鱼评价药物抗阿尔茨海默症药效的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的培养皿直径为80-90mm，密度控制在10-50个卵/皿。

5.根据权利要求1所述的利用转基因斑马鱼评价药物抗阿尔茨海默症药效的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的胚胎培养液为含0.5mg/L亚甲基蓝的系统循环水。

6.根据权利要求1所述的利用转基因斑马鱼评价药物抗阿尔茨海默症药效的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的恒温培养箱中培养的条件：在28.0-30.0℃恒温培养箱中培养至2～7dpf。

7.根据权利要求1所述的利用转基因斑马鱼评价药物抗阿尔茨海默症药效的方法，其特征在于，所述步骤(3)中的药物浓度设置2-3个梯度剂量，具体确定方法为：将转基因的斑马鱼幼鱼置于反应容器中，使之暴露于梯度浓度的药物中，显微镜下观察幼鱼形态，判断是否出现毒性作用，确定安全浓度范围，进一步确定2-3个梯度剂量。

8.根据权利要求1所述的利用转基因斑马鱼评价药物抗阿尔茨海默症药效的方法，其特征在于，所述步骤(4)中的实验条件参数为：反应容器包括96孔板、48孔板、24孔板、12孔板和6孔板，温度保持在28.0-30.0℃，行为追踪时长为1-24h，每小时包含3个光/暗周期循环，光照10min和黑暗10min。

9.根据权利要求1所述的利用转基因斑马鱼评价药物抗阿尔茨海默症药效的方法，其特征在于，所述步骤(6)中的阿尔茨海默症相关指标包括乙酰胆碱酯酶、乙酰胆碱酯转移酶、丙二醛及超氧化物歧化酶中的一种或多种。

10.根据权利要求1所述的利用转基因斑马鱼评价药物抗阿尔茨海默症药效的方法，其特征在于，所述步骤(6)中的分子生物学方法包括免疫印迹、聚合酶链式反应、酶联免疫吸附实验、免疫组化和免疫荧光中的一种或多种。