[发明专利]一种产物专一性提高的环糊精葡萄糖基转移酶突变体R81T

说明书

本发明提供了一种产物专一性提高的环糊精葡萄糖基转移酶突变体R81T，属于酶工程领域，所述CGTase突变体R81T的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。本发明还提供了包含所述SEQ ID NO.3的核苷酸序重组表达载体pET‑r81t，以及包含该重组表达载体pET‑r81t的重组菌。

技术领域

本发明涉一种产物专一性提高的环糊精葡萄糖基转移酶突变体R81T，属于酶工程领域。

背景技术

环糊精葡萄糖基转移酶(Cyclodextrin glycosyltransferase,CGTase)能够催化包括环化，水解，偶联和歧化在内的四种反应，其中环化反应是特征性反应，该反应可以以淀粉类基质作底物合成环糊精(Cyclodextrin,CD)。目前，酶法合成是工业生产环糊精的主要方法。常见的环糊精包括α-环糊精(α-CD)、β-环糊精(β-CD)和γ-环糊精(γ-CD)，分别为通过α-1,4糖苷键连接的6、7和8个葡萄糖单元组成的。环糊精分子具有外部亲水性和内部疏水性，其疏水性空腔可以包裹疏水性分子或基团形成包合物，改变被包埋物的物理及化学性质，因此在食品、药品和化妆品等方面有着广泛的应用。

CGTase生产环糊精最不利的条件之一是产物特异性差，所有已知的CGTase生产的环糊精产物均是α-、β-和γ-CD的混合物，不利于产物的分离纯化。

发明内容

本发明的要解决的技术问题在于提供一种产物专一性提高的环糊精葡萄糖基转移酶突变体R81T，该突变体提高了β-CD产物的专一性，为以后产物的分离纯化带来便利。

本发明是通过如下技术方案来实现的：

本发明提供了一种编码CGTase突变体R81T的核苷酸序列，其核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示。

一种上述核苷酸序列编码的CGTase突变体R81T，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

一种重组表达载体pET-r81t,它包含了SEQ ID NO.3所示核苷酸序列，表达载体为pET-24a。

一种重组菌，它包含了重组表达载体pET-r81t，所述的菌株为大肠杆菌BL21(DE3)。

CGTase突变体R81T与野生型相比，进行了一个位点的定点突变，将SEQ ID NO.2所示的CGTase N末端起第81位氨基酸的精氨酸(R)置换为苏氨酸(T)，其催化得到的环糊精产物中，α-CD产量降低，相对提高了β-CD产物的专一性。

制备环糊精葡萄糖基转移酶突变体R81T的方法包括以下步骤：

(1)利用PCR技术,以含野生酶基因(序列如SEQ ID NO.1)的表达载体pET24a-cgt为模板进行定点突变,所用引物分别是：

正向引物:5’-CTTAACAAAATATTGTGGTGGAGATTGGCAAGG-3’，

反向引物:5’-TTTTTACAATCCTCCGAATAAAGTTCTCCTGATGGG-3’。

用Q5定点突变试剂盒(NEB)进行定点突变，得到突变表达载体pET-r81t，将表达载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，用卡那霉素抗性筛选及测序确定含CGTase突变体的重组菌株；

(2)将步骤(1)得到的突变菌株与未突变的原始重组菌株接种于含有50μg/mL卡那霉素LB液体培养基中，37℃、200r/min培养过夜培养获得种子液；将种子液以体积比1％-2％的量接种于含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，待OD₆₀₀达为0.6-0.8时，加入终浓度0.4mM的IPTG诱导，诱导温度为20℃，诱导时间为15小时；